引言：肝癌治疗挑战与乳酸化的新视角
肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的主要原因之一，其侵袭性强且治疗抵抗性高，构成了重大的临床挑战。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）已显著改善临床结局，但肿瘤病因高度复杂和异质，患者间的治疗反应、疾病进展速度和生存预后存在显著差异。近年来，包括乳酸化在内的蛋白质翻译后修饰，通过动态调节信号通路、代谢重编程和表观遗传重塑在驱动肿瘤进展中显示出重要性。其中，乳酸化作为一种与代谢相关的修饰，已成为细胞能量代谢和免疫微环境的关键调节因子。肿瘤细胞代谢的一个标志是瓦博格效应，即癌细胞即使在富氧条件下也优先通过有氧糖酵解代谢葡萄糖，导致乳酸过度积累。乳酸不仅作为代谢副产物，还作为信号分子调节细胞周期和肿瘤增殖。在肿瘤微环境中，乳酸通过MCT1/LDHB依赖性途径优先为调节性T细胞的能量代谢和免疫抑制功能提供燃料，同时损害效应T细胞活性以促进免疫逃逸。肝癌的标志性特征，包括增强的糖酵解和乳酸积累，可能为乳酸化修饰提供了微环境基础。先前研究表明，乳酸化相关基因（LRGs）可作为包括肝癌在内的多种癌症的预后标志物和治疗靶点。ICIs的引入显著改变了肝癌的治疗格局，但由于其复杂的发病机制和免疫抑制性肿瘤微环境，ICIs单药治疗的应答率仍不理想。因此，基于LRGs模型预测肝癌预后和治疗反应性，有助于为肝癌识别新的治疗靶点和策略。
方法：数据整合与模型构建
本研究从公开的TCGA和GEO数据库获取肝癌基因表达数据及对应临床信息。使用ConsensusClusterPlus软件包对基于文献提取的332个LRGs进行共识聚类分析，将TCGA-LIHC队列的368名肝癌患者划分为不同的分子亚型。通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法量化肿瘤免疫微环境（TIME）中免疫细胞的相对丰度，并利用免疫表型评分（IPS）全面评估肿瘤内免疫微环境和肿瘤抗原呈递谱。使用基因集变异分析（GSVA）评估不同LRGs亚型间通路活性的差异。通过“maftools” R包比较体细胞突变数据，分析显著突变基因，并基于COSMIC数据库分析突变特征。利用MethylMix软件包识别差异甲基化驱动基因，并通过“Complex Heatmap” R包分析两个LRGs亚型间拷贝数变异（CNV）的显著差异。通过单变量Cox回归、LASSO Cox回归和多变量逐步回归分析，筛选与预后相关的核心LRGs，构建乳酸化相关基因特征（LRGS）风险评分模型。使用“oncoPredict” R包预测化疗反应，并通过Connectivity Map（Cmap）数据库利用eXtreme Sum（XSum）算法筛选潜在小分子药物。通过UALCAN和人类蛋白质图谱数据库（HPA）验证关键基因的表达。
结果一：基于LRGs的肝癌患者分型及其特征
基于332个LRGs的共识聚类分析将368名TCGA-LIHC患者稳健地划分为两个亚型：簇1和簇2。生存分析显示，簇2患者的总生存率显著高于簇1患者，表明LRGs介导的亚型在肝癌患者中具有预后价值。PCA证实了两个亚型之间存在明显的转录组学差异。热图结果显示，两个簇之间的LRGs表达和临床特征存在显著差异。
结果二：LRGs亚型间的生物学功能与肿瘤免疫微环境差异
GSVA富集分析揭示了两个簇之间显著的生物学功能差异。簇1显示出增殖性通路（如有丝分裂纺锤体和G2/M检查点调控）的显著富集，而簇2则表现出KRAS信号通路的抑制以及凝血和外源物代谢通路的增强。对28种免疫细胞浸润水平的分析显示，簇1的整体免疫活性更高，其10种免疫细胞类型的浸润显著增加，包括活化的CD4+T细胞、树突状细胞（DCs）和中枢记忆CD4+T细胞。
结果三：LRGs亚型间的突变与表观遗传学差异
体细胞突变图谱分析发现，在显著突变基因中，簇1的TP53和OBSCN突变频率显著高于簇2。基于COSMIC V2数据库的分析表明，簇1的突变特征主要为特征5和特征24，簇2主要为特征4和特征16。在拷贝数变异方面，簇1表现出更多的拷贝数缺失和几个拷贝数扩增，其总体CNV负荷也显著更高。MethylMix分析在两个簇之间鉴定了24个差异甲基化驱动基因，并伴有相应的表达变化。
结果四：LRGS模型的构建与验证
通过差异表达分析、单变量Cox回归、LASSO Cox回归及多变量逐步回归，最终确定了三个核心预后生物标志物：LPCAT1、PSRC1和PLOD2。基于此构建了LRGS预后特征模型。该模型将患者分为高危（高LRGS评分）组和低危（低LRGS评分）组。生存分析表明，高LRGS组患者的总生存期显著更差。该模型在TCGA队列中显示出稳健的预测准确性，并在独立队列GSE116174中得到验证。多变量分析证实LRGS是独立的预后因素。此外，结合年龄、性别、肿瘤分期和LRGS评分的列线图也显示出稳健的预后性能。
结果五：关键LRGs的表达验证
基因和蛋白水平分析证实，LPCAT1、PSRC1和PLOD2三个基因在肝癌组织中的表达水平均显著高于癌旁正常组织。来自HPA数据库的免疫组化染色结果进一步在蛋白水平验证了LPCAT1和PLOD2在肝癌组织中的过表达。
结果六：LRGS模型在化疗与免疫治疗中的预测价值
利用XSum算法，研究预测小分子药物STOCK1N.35696可能是高危LRGS患者的潜在治疗候选药物。通过“oncoPredict”预测药物反应发现，高LRGS组患者对AZD5153、cediranib、foretinib和vorinostat的预估半数抑制浓度（IC50）值显著低于低LRGS组，提示高LRGS患者对上述药物具有更高的敏感性。在免疫治疗预测方面，高LRGS组中关键免疫检查点基因集（IAP, ICP, MHC）的表达水平更高。使用肿瘤免疫功能障碍与排斥（TIDE）工具分析表明，低LRGS患者可能从免疫治疗中获得更好的结局。IPS分析也显示低LRGS组的评分更高。此外，LRGS与免疫治疗相关通路的关联分析支持了LRGS与免疫治疗反应的相关性。在独立的黑色素瘤免疫治疗队列中验证也发现，低LRGS组患者的总生存期显著改善。
讨论与结论
本研究发现基于LRGs可以对肝癌患者进行分类，并系统分析了两类亚型在生物学功能、TIME特征、突变模式、遗传和甲基化变化等方面的差异。研究构建的LRGS模型能有效将肝癌患者分层为不同的预后组，高LRGS患者预后更差。该模型在预测肝癌患者临床结局和化疗/免疫治疗效果方面显示出潜力，有望成为评估肝癌患者预后、化疗敏感性及ICIs反应的综合工具，为肝癌的精准治疗提供了新的思路。然而，研究目前缺乏具体的临床数据和实验验证，未来需要通过更大规模的队列以及体内外实验研究进一步优化临床治疗策略。
