2 嵌合抗原受体T细胞疗法
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是通过基因工程改造患者自身的T细胞，使其表达能够特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR），从而实现对肿瘤的精准杀伤。其核心结构包括胞外抗原识别域、跨膜域和胞内信号域。经过多代发展，新一代CAR-T细胞通过加入共刺激域（如CD28或4-1BB）、可诱导的细胞因子模块（第四代TRUCKs）或整合多重信号通路（第五代）等手段，显著提升了T细胞的激活、增殖、持久性和抗肿瘤活性。在胆道癌（BTC）中，CAR-T疗法主要靶向MUC1、表皮生长因子受体（EGFR）、整合素αvβ6、CD133和B7-H3等肿瘤相关抗原。
2.1 MUC1
黏蛋白1（MUC1）是一种在正常生理状态下维持上皮屏障功能的跨膜糖蛋白，在BTC等多种上皮性癌症中表达失调、异常糖基化且失去顶端膜极性，从而促进肿瘤增殖、侵袭和转移。研究表明，第二代抗MUC1 CAR-T细胞能有效裂解Tn-MUC1阳性的胆管癌细胞（CCA），并在异种移植模型中显著抑制肿瘤生长。更进一步，第四代抗MUC1 CAR-T细胞表现出对高表达MUC1细胞的特异性杀伤（66.03%的特异性裂解），并能有效破坏3D肿瘤球体。为了克服程序性死亡配体-1（PD-L1）导致的T细胞耗竭，研究者还构建了同时表达PD-1-CD28转换受体的双功能抗MUC1 CAR-T细胞，在高PD-L1环境中展现出更强的增殖能力和杀伤活性，且耗竭标志物更少。
2.2 表皮生长因子受体（EGFR）
表皮生长因子受体（EGFR）在包括BTC在内的多种上皮性肿瘤中过表达，是驱动肿瘤增殖、分化、迁移和存活的关键分子。一项针对晚期不可切除或转移性EGFR阳性（表达>50%）BTC患者的I期临床试验显示，在接受纳布紫杉醇和环磷酰胺的预处理化疗后，输注自体CAR-T-EGFR细胞，在可评估患者中，1例达到完全缓解，10例疾病稳定，中位无进展生存期（PFS）为4个月。治疗相关毒性主要为可管理的1-2级黏膜和皮肤反应（源于正常组织的基底EGFR表达），以及一例可逆的细胞因子释放相关急性肺水肿。另一病例报告显示，一例晚期CCA患者在CAR-T-EGFR治疗后获得8.5个月的部分缓解，后续序贯接受CAR-T-CD133治疗，进一步延长了缓解期。
2.3 整合素αvβ6
整合素αvβ6是一种在上皮源性肿瘤中高表达而在正常组织中表达极低的受体蛋白，参与肿瘤侵袭、转移并可能通过调节免疫抑制性肿瘤微环境（TME）影响疗效。在CCA中，其表达率高达73.3%，且高表达与患者预后不良显著相关。研究者开发了靶向整合素αvβ6的第二代（A20-2G CAR）和第四代（A20-4G CAR）CAR-T细胞，体外实验均显示出对αvβ6阳性CCA细胞系的特异性细胞毒性，且在3D肿瘤球模型中表现出强大的浸润和杀伤效力，其中第四代CAR-T在增殖能力和长期抗肿瘤活性上更优。为了进一步克服PD-L1介导的免疫抑制，团队还构建了第五代CAR-T细胞（A20 CAR5），其在靶向整合素αvβ6的同时，能分泌抗PD-L1单链可变区片段（scFv）以局部阻断PD-1/PD-L1通路，在长期共培养和重复肿瘤攻击实验中表现出更强的持久性和细胞毒性。
2.4 CD133
CD133是多种实体瘤中广泛认可的癌症干细胞标志物，与肿瘤发生、转移、耐药和复发密切相关。在胆道癌中，CD133高表达与不良预后和高复发率显著相关。第四代靶向CD133的CAR-T细胞在体外展现出强大的细胞毒性，最大特异性裂解率达57.59% ± 9.62%，并伴有干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的显著上调。临床上，一例对CAR-T-EGFR治疗产生耐药的晚期CCA患者，在接受CD133靶向CAR-T疗法后获得了持续4.5个月的部分缓解，首次在实体瘤中验证了“CAR-T鸡尾酒疗法”（序贯靶向不同抗原）的可行性。
2.5 B7-H3
B7-H3是B7免疫调节蛋白家族成员，在多种实体瘤中过表达，与免疫抑制性微环境和不良临床预后密切相关。研究证实，B7-H3特异性CAR-T细胞能有效清除B7-H3阳性的CCA细胞，并在异种移植小鼠模型中显著抑制肿瘤进展、延长生存期。尽管显示出显著的抗肿瘤活性，但其在实体瘤中的疗效仍受TME诱导的T细胞功能障碍限制。为了克服此问题，研究者探索将其与TANK结合激酶1（TBK1）抑制剂联用。TBK1抑制不仅能增敏肿瘤细胞对CAR-T细胞释放的IFNγ和TNFα的反应，还能防止CAR-T细胞耗竭并促进其增殖和效应功能，从而在患者来源的器官型肿瘤球（PDOTS）和单培养肿瘤球模型中显著改善治疗效果。
3 肿瘤浸润淋巴细胞疗法
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法是一种基于从患者自身肿瘤组织中分离出的T淋巴细胞的过继细胞治疗方法。其优势在于无需基因工程，利用TME中天然具有肿瘤识别能力的T细胞，扩增后回输以增强抗肿瘤免疫应答，降低了基因修饰相关不良事件的风险。在BTC中，TIL已展现出靶向肿瘤特异性抗原的潜力，例如能够识别源自FGFR2-TDRD1融合断裂区的新抗原。临床上，一例转移性胆管癌患者在接受含有约25%对ERBB2IP突变有反应的T细胞的TIL输注后，实现了超过一年的持续肿瘤稳定和部分消退；疾病进展后，第二次输注高度纯化的突变特异性TIL再次导致肿瘤缩小。优化策略方面，研究比较了传统的CD3激动剂扩增和肿瘤抗原驱动扩增两种方法，发现后者扩增的TIL在体外细胞毒性更强，体内持久性也显著更优。此外，基于改造外周血来源T细胞的“三合一”策略创造了超级循环TIL样细胞（ScTILs），在针对晚期BTC的临床试验中显示出可控的安全性，且在中位总生存期（18.3个月）上优于现有标准治疗方案。
4 自然杀伤细胞疗法
自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的关键组分，能够在不需抗原特异性启动的情况下识别并杀伤肿瘤细胞，且其功能不受主要组织相容性复合体（MHC）限制。近年来，基于诱导多能干细胞（iPSC）分化的NK细胞（iNK细胞）因其“现货型”产品特性而备受关注。研究已成功开发出无饲养层单层培养系统，可高效诱导出高纯度、功能性的iNK细胞，其在基因表达水平上与外周血来源的NK细胞高度相似，在2D和3D肿瘤球模型中对CCA细胞系（如KKU-055和KKU-213A）的杀伤能力优于传统的NK-92细胞系。临床前研究证实，体外扩增的NK细胞能在CCA异种移植模型中显著抑制肿瘤生长。与抗EGFR单克隆抗体联用可显著增强NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。工程化的CAR-NK细胞（如靶向cMET的CAR-NK）也显示出针对特定靶点的精准杀伤潜力。一项I/IIa期临床试验评估了同种异体NK细胞联合程序性死亡[蛋白]-1（PD-1）抑制剂帕博利珠单抗治疗化疗难治性晚期BTC的安全性和有效性，结果显示联合疗法无直接药物相关的严重不良事件，符合方案集的总缓解率（ORR）达到50.0%，疾病控制率（DCR）为62.5%，中位PFS为4.1个月，显著优于帕博利珠单抗单药的历史数据。
5 细胞因子诱导的杀伤细胞疗法
细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞是一群异质性的免疫效应细胞，其主要成分是CD3+CD56+的NKT样细胞，兼具T细胞的强体外增殖能力和NK细胞的非MHC限制性杀伤功能。CIK细胞主要通过颗粒酶-穿孔素途径诱导肿瘤细胞凋亡，其细胞毒性依赖于NKG2D受体识别肿瘤细胞表面表达的应激相关配体（如MICA/B）。在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠的人CCA异种移植模型中，CIK细胞表现出特异性浸润肿瘤组织并有效抑制肿瘤生长的能力。研究表明，将CIK细胞与树突状细胞（DC）共培养可增强其抗肿瘤活性。此外，将细胞因子激活的杀伤（CAK）细胞（与CIK类似）与西妥昔单抗联用可通过ADCC显著增强对CCA细胞系的杀伤；而吉西他滨预处理可通过上调肿瘤细胞表面MICA/B的表达，增强CAK细胞通过NKG2D受体介导的细胞毒性。过表达诱导性T细胞共刺激分子（ICOS）能显著改善CIK细胞的增殖和细胞因子（尤其是IFN-γ）分泌，从而增强其对BTC细胞的杀伤活性。临床研究数据支持了CIK/CAK细胞在BTC治疗中的安全性和初步疗效，有研究报道5例化疗耐药的转移性BTC患者接受吉西他滨联合CAK治疗后，2例达到完全缓解，3例疾病稳定，且未观察到与细胞输注相关的严重不良事件。
6 T细胞受体工程化T细胞疗法
T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法通过对患者T细胞进行基因重编程，使其表达能够识别由癌细胞MHC分子呈递的特定肿瘤抗原（包括细胞内蛋白来源的抗原）的新型T细胞受体，从而有效清除肿瘤。这使其靶点范围远超仅限于表面抗原的CAR-T疗法，在实体瘤治疗中极具前景。癌症-睾丸抗原（CTAs）因其在多种癌症中特异性表达，而在正常组织中主要局限于睾丸和胎盘等免疫豁免部位，被视为理想的免疫治疗靶点。数据显示，约33.7%的肝内胆管癌（iCCA）病例共表达CTAs和HLA I类分子。针对纽约食管鳞状细胞癌-1（NY-ESO-1）和黑色素瘤相关抗原（MAGE）A3等CTA的TCR-T细胞已在临床前和临床环境中展现出强大的抗肿瘤活性。此外，甲胎蛋白（AFP）在部分iCCA肿瘤细胞中也有表达，且这些AFP阳性细胞具有癌症干细胞特性，靶向AFP的TCR-T策略也可能适用于AFP阳性的iCCA患者。针对驱动突变（如KRAS和TP53）的TCR-T疗法也正在探索中，一项I/II期试验（NCT05194735）初步报告显示，靶向特定KRAS和TP53突变的TCR-T产品可以成功制造和输注，且未出现剂量限制性毒性。
7 挑战与优化策略
过继细胞免疫疗法在BTC的临床应用中面临多重挑战。首要障碍来自BTC高度异质性和强免疫抑制性的肿瘤微环境（TME），其致密的细胞外基质、免疫抑制细胞（如M2型巨噬细胞、调节性T细胞[Tregs]）以及转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）等因子构成强大屏障，阻碍药物递送、削弱免疫细胞功能并限制其浸润。效应细胞本身也存在功能缺陷和存活挑战，如CAR-T细胞体内持久性不足、易发生耗竭；TIL和CIK疗法中细胞成分混杂；NK细胞对冻融过程敏感等。靶点相关挑战包括肿瘤细胞通过下调人类白细胞抗原（HLA）分子或靶抗原实现免疫逃逸（抗原丢失），以及BTC的高异质性导致靶点表达在患者间和瘤内存在显著差异。“脱靶/脱瘤”毒性也是关键安全问题，当靶抗原在正常组织中也有表达时，可能攻击健康组织。
为应对这些挑战，研究者提出了多层次的优化策略。在基因工程层面，通过改造CAR结构（如使用PD-1–CD28转换受体将抑制信号转为刺激信号）、利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术同时敲除多个免疫抑制分子（如PD-1、TGF-β、IL-10、IL-6受体）、构建装甲型CAR-T/TCR-T细胞（分泌促炎细胞因子重塑TME）以及引入“关闭开关”或自杀基因等安全机制，旨在增强细胞活性、持久性和安全性。开发双靶点CAR结构和序贯治疗策略，可有效应对肿瘤细胞的抗原逃逸和异质性。逻辑门控CAR系统则有望在克服异质性的同时最大限度降低脱靶毒性。
在联合治疗策略上，过继细胞疗法与免疫检查点抑制剂（ICIs）、放疗或化疗联用显示出协同效应。例如，B7-H3 CAR-T与PD-1阻断剂联用可增强肿瘤清除；低剂量放疗可优化TME，增强过继T细胞的肿瘤浸润和抗肿瘤活性；吉西他滨等化疗药物可诱导免疫原性细胞死亡，与过继细胞疗法协同。
在制造工艺和创新产品形式上，iPSC分化技术的进步使得大规模生产“现货型”NK细胞产品成为可能。超级循环TIL样细胞（ScTILs）策略避免了肿瘤切除和清髓化疗，生产时间更短、安全性更优。TCR样抗体作为“现货型”产品，提供了另一种靶向细胞内抗原的途径。纳米技术的引入则能实现基因编辑工具、RNA或细胞因子的靶向递送，或作为调控效应细胞功能的新手段。
此外，新兴策略开始关注重塑TME中的非肿瘤组分，如靶向癌症相关成纤维细胞（CAFs）的成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR-T细胞，通过清除这些支持性细胞来破坏免疫抑制网络和物理屏障。嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）能够穿透致密肿瘤并将M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）极化为促炎的M1表型。工程化T细胞通过分泌Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）和淋巴趋化素（lymphotactin）来招募和激活树突状细胞（DCs），从而促进抗原扩散和内源性T细胞克隆扩增，有效对抗肿瘤异质性。
8 总结
胆道癌的治疗因其高度异质性和免疫抑制性微环境面临严峻挑战。以CAR-T、TIL、NK、CIK和TCR-T为代表的过继细胞疗法，通过激活或工程化改造免疫细胞来精准靶向肿瘤，为晚期患者带来了新希望。尽管在靶点选择和临床研究中显示出潜力，该领域仍受限于TME抑制、效应细胞浸润和功能有限、靶点异质性及脱靶毒性等关键瓶颈。未来的突破有赖于基因工程、联合治疗（如与免疫检查点抑制剂联用）以及创新制造工艺等多维度策略的协同应用，以共同克服这些障碍，从而推动临床转化并改善患者预后。
