引言
共价药物——通过与靶蛋白形成共价键发挥生物效应的疗法——在过去二十年中正经历工业界和学术界兴趣的激增。目前，至少有75种共价药物获得监管批准，靶向传统靶点类别以及其他方法曾告失败的更具挑战性的蛋白质。在许多情况下，共价靶向的独特方面对于药物分子的功效至关重要。著名的成功案例包括针对KRASG12C、EGFRL858R， T790M和BTK的疗法发现，而针对KRASG12D、WRN解旋酶和p53Y220C的分子最近已被披露，如果获得监管批准，将代表重大成就。该领域兴趣的增长催化了创新，并推进了对由共价相互作用产生的独特考量因素的理论理解。
选择性共价配体通常被认为通过两步机制与靶标残基结合，首先是初始的非共价结合（由平衡常数KI量化），随后是不可逆的共轭（由速率常数kinact量化）。因此，与主要受热力学支配选择性的非共价药物不同，开发共价药物涉及优化可逆相互作用和与蛋白质靶标结合速率两者的结合。蛋白质-药物结构——通常通过X射线晶体学获得并存储在蛋白质数据库（PDB）中——为理解决定这些因素的相互作用提供了有用的资源。
KRAS
共价KRASG12C抑制是药物发现领域的一个里程碑式成就，后续针对KRAS的研究一直是该领域创新的源泉。KRAS是一种GTP酶，在细胞存活和增殖信号通路中发挥作用。它可以被视为一个“分子开关”，在KRAS-GTP（开）和KRAS-GDP（关）蛋白复合物之间处于精细调节的平衡中。致癌突变扰乱了这种平衡，有利于GTP结合（激活和促增殖）的KRAS。KRAS突变在胰腺癌、结直肠癌和肺腺癌等多种癌症中很常见。
KRASG12C
UCSF的Shokat课题组开创性的工作使用二硫键拴系法识别了靶向KRASG12C的共价片段。通过大量的药物化学努力，这些片段被开发成更有效的基于丙烯酰胺的共价抑制剂，最终产生了ARS-1620——一种含有丙烯酰胺的共价KRASG12C抑制剂，可选择性地结合并“捕获”KRASG12C-GDP。它占据GDP结合位点附近的一个口袋，阻止辅因子转换，将KRASG12C锁定在GDP结合的“关闭”状态。
KRASG12C-GDP的几个特性使其易受共价抑制。它包含一个独特的半胱氨酸残基，这是其他小GTP酶天然缺乏的。Cys12还邻近一个质子化的赖氨酸残基（Lys16），该残基可重新用于通过极化丙烯酰胺并稳定结合过程中形成的新生氧阴离子来增强反应性。这种丙烯酰胺活化创造了与KRASG12C-Cys12的高特异性反应性（kinact），从而弥补了由浅口袋导致的弱可逆亲和力。
ARS-1620的成功催生了两种疗法（sotorasib和adagrasib），两者均被批准用于治疗由KRASG12C驱动的非小细胞肺癌。然而，从科学角度看，虽然第一代KRASG12C-GDP靶向药物代表了巨大创新，但临床反应不尽如人意，患者通常在4-6个月内产生耐药性。此外，靶向KRASG12C-GDP的一个重大缺陷是，在G12C系统中，GTP结合物种占大多数，这意味着目标结合的最大速率受限于GTP水解速率。
为了克服第一代药物的局限性，近期的项目开始靶向KRASG12C-GTP，旨在更快地结合KRAS并克服那些增加信号活性蛋白比例的耐药机制。Revolution Medicines的研究人员开发了一类新的大环KRAS抑制剂，它们通过与亲环蛋白A（CypA）结合，形成KRAS:CypA:抑制剂三元复合物，从而阻断KRAS-效应子结合，并选择性标记更普遍的GTP结合KRAS。Bridgebio Oncology Therapeutics也披露了首个同时靶向KRASG12C-GTP/GDP的双重抑制剂BBO-8520。
KRASG12D
靶向KRASG12C分子的成功开发激发了近期将类似方法应用于更常见突变体KRASG12D的努力。为了实现这一目标，并关键地获得对野生型KRAS的选择性，科学家们寻求能够直接与Asp12相互作用的分子。然而，天冬氨酸羧酸盐温和的亲核性使其共价捕获极具挑战性。
尽管存在挑战，Revolution Medicines最近披露了一种共价靶向KRASG12D的临床候选药物zoldonrasib。与elironrasib类似，zoldonrasib也是一个带有反应弹头的大环分子，遵循类似的抑制机制来阻断与下游效应子的相互作用。该工作始于用一个连接体将先前鉴定的大环可逆结合剂与氮丙啶弹头功能化，该分子能够在生理pH下6小时内标记34%的KRASG12D。通过对连接体进行刚性化、对氮丙啶进行环丙基化（可能稳定形成的阳离子中间体从而加速结合）以及甲基化（以提高胃稳定性），并优化大环部分以改善药代动力学性质和生物利用度，最终创造了zoldonrasib——首个进入临床开发的共价KRASG12D抑制剂。
zoldonrasib的一个显著特征是其氮丙啶弹头的反应活性极其温和，在生理条件下与模型羧酸盐未检测到反应。这种反应性通过相对紧密的可逆结合（KI= 149 nM）得到加速，该结合将氮丙啶定位在突变体Asp12的近距离内，但结合速率相对于其他疗法仍然较慢。然而，这在体内已足以实现显著的共价捕获，从而创造了相对于野生型KRAS的选择性窗口。共价相互作用仍然保留了几个目的，尽管氮丙啶与KRASG12D之间的反应性很弱。
激酶
激酶在许多细胞功能中充当信号蛋白，通常在疾病中发生突变、差异表达或差异激活。许多激酶是已知的药物靶点，截至2025年，已有13种共价激酶抑制剂获得FDA批准。共价激酶抑制剂相对于非共价对应物具有一些关键优势。最显著的是，永久性相互作用意味着共价抑制剂更容易在竞争中胜过ATP——这对于靶向守门员突变（常见的耐药突变，能增强ATP亲和力同时降低抑制剂结合亲和力）特别有用。通过靶向仅存在于某个子集或单个蛋白质中的半胱氨酸残基，共价激酶抑制剂还可以克服可逆化合物经常遇到的选择性问题。
EGFR和ErbB家族
EGFR已成为一个系列药物靶点，截至2025年，有七种FDA批准的共价EGFR抑制剂。EGFR最初由第一代可逆抑制剂（如gefitinib）靶向。遗憾的是，gefitinib的耐药性通常在10-14个月内通过T790M守门员突变出现。辉瑞科学家的关键工作表明，在gefitinib的4-氨基喹唑啉核心上简单地添加一个丙烯酰胺以结合Cys797，可以创造一种强效的共价ErbB家族抑制剂，命名为canertinib。虽然canertinib未进展超过II期临床试验，但它为共价ErbB家族抑制提供了概念验证。
第二代ErbB家族抑制剂（如afatinib、dacomitinib和neratinib）也在2000年代末和2010年代获得批准。尽管共价靶向结合有望克服守门员突变蛋白增加的ATP亲和力，但这些药物是更强的野生型EGFR抑制剂，因此剂量限制性毒性在很大程度上阻止了第二代EGFR抑制剂以足够浓度给药来有效克服T790M突变。
进一步的尝试旨在开发第三代EGFRT790M, L858R选择性抑制剂。阿斯利康的研究人员开发了osimertinib——一种共价抑制剂，对EGFRT790M, L858R具有32倍的体内选择性窗口。Osimertinib的选择性源于两个效应：激活的L858R突变稳定了EGFR的活性构象，osimertinib对此形式具有更高的亲和力；其次，osimertinib中嘧啶/吲哚环系统的边缘与守门员突变体Met790形成比野生型Thr790更强的疏水相互作用，导致吲哚系统在与守门员突变体结合时倾向于采用翻转构象。
尽管osimertinib非常有效，但耐药性很常见，患者对治疗的反应通常只持续9-11个月。最常见的耐药机制是C797S突变，这推动了当前开发EGFRT790M， C797S, L858R选择性分子的工作。一篇有前景的最新出版物披露了靶向EGFR铰链上另一个半胱氨酸（Cys775）的基于丙烯酰胺的共价片段，这些片段对双重耐药突变体EGFRT790M, C797S具有活性，为开发第四代EGFR抑制剂提供了可能的起点。
布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）
布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂ibrutinib的成功是过去20年共价药物发现增长的关键驱动力之一。BTK在B细胞受体信号通路中发挥核心作用。Celera Genomics的研究人员在尝试获得相对于其他激酶的选择性时发现了第一个共价BTK抑制剂。他们首先确定了一个可逆分子，然后将该可逆抑制剂功能化，连接了一个哌啶连接的丙烯酰胺以结合半胱氨酸。这个分子被命名为ibrutinib，最终于2013年被批准用于治疗几种淋巴瘤。
遗憾的是，ibrutinib脱靶标记其他具有F2位点半胱氨酸的激酶（如JAK3和EGFR）会导致治疗中的不良反应，因此第二代抑制剂旨在克服这些选择性问题。其中第一个获得批准的acalabrutinib，用吡啶酰胺系统取代了二芳基醚，获得了与Ser538和Asp539额外的氢键。Acalabrutinib还用反应活性极温和的丁炔酰胺弹头取代了丙烯酰胺，导致其与BTK的结合速度比ibrutinib慢2.75倍，但对一组激酶的选择性有所改善。另一个获批的第二代抑制剂zanubrutinib与Glu475形成了一个额外的氢键，有助于提高效力和靶标选择性。
最近，靶向BTK的氰基丙烯酰胺rilzabrutinib获得FDA批准用于治疗免疫性血小板减少症。这是向前迈出的重要一步：rilzabrutinib既是首个获得FDA批准的氰基丙烯酰胺，也是首个获批的合成氧杂环丁烷。氰基丙烯酰胺是一类半胱氨酸选择性共价弹头，由于α-质子的酸性，可以进行逆迈克尔加成，因此是可逆的。其可逆共价性质是有利的，因为尽管它也结合其他在相同位置含有半胱氨酸的激酶，但从BTK解离最慢，从而选择性延长了靶标停留时间。
Janus激活激酶（JAK）
Janus激酶是一个非受体酪氨酸激酶家族，在JAK/STAT通路中发挥作用。JAK3主要在造血细胞中表达，其突变或敲除已知会损害免疫功能。因此，JAK3是开发免疫抑制药物的一个有吸引力的靶点；然而，任何药物都需要对其他Janus激酶具有高选择性，因为JAK2抑制与血液学不良事件有关。
JAK3含有一个独特的活性位点半胱氨酸（Cys909），可被用作开发选择性抑制剂的手柄。辉瑞的研究人员通过对tofacitinib支架进行改造，产生了首个上市的JAK3靶向共价药物ritlecitinib。研究发现，将氰乙酰胺替换为丙烯酰胺，并操纵分子使哌啶环相对于吡咯并嘧啶系统翻转成反式构象，可以将丙烯酰胺定位在半胱氨酸附近，从而产生强效抑制剂。进一步的优化引入了2-S-甲基取代基，增强了效力并减缓了GST介导的清除，从而创造了ritlecitinib。
ritlecitinib是一个卓越的分子，可以教会该领域的从业者关于共价抑制的几个经验。令人惊讶的是，仅由铰链结合基序和一个丙烯酰胺组成的简单分子竟然能具有足够的选择性用作药物。实际上，它以亚微摩尔级的KI可逆地结合至少四种激酶——不包括JAK3，它与JAK3的可逆亲和力明显较弱。这种可逆选择性的缺乏通过其与JAK3-Cys909的极快特异性反应性（kinact= 2.31 s-1）得到弥补，这比其他激酶快得多，从而创造了一个kinact/KI选择性窗口。
成纤维细胞生长因子受体（FGFR）
成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族是一个受体酪氨酸激酶家族，其过表达或导致组成型激活的突变与肿瘤发生有关，FGFR已成为热门药物靶点。早期工作确定了工具化合物PD173074，其特征是连接了一个3,5-二甲氧基苯基基团的铰链结合基序——这一药效基团被证明对提供相对于其他激酶的选择性至关重要。
最近，共价FGFR抑制剂已显示出临床疗效。首个获批的共价FGFR抑制剂futibatinib由Taiho制药的科学家开发。在激酶组筛选期间，他们发现了一种手性丙烯酰胺，对FGFR2和EGFRdel19/T790M突变体具有中等效力。分离和测试发现，每种对映体对两种受体之一表现出偏好——S-对映体将丙烯酰胺朝向FGFR2中的Cys488（位于口袋顶部的P环上），而R-对映体朝向EGFR中的Cys797（位于口袋底部αD螺旋的N端）。用FGFR选择性的3,5-二甲氧基苯基基团替换占据疏水口袋的喹啉，用吡唑并嘧啶核心替换铰链结合剂，并优化从铰链到疏水口袋结合剂的连接体，最终创造了futibatinib——一种细胞活性的泛FGFR抑制剂，于2023年获得FDA批准用于治疗由FGFR2基因融合或重排驱动的胆管癌。
不幸的是，泛FGFR抑制剂备受具有挑战性的副作用困扰。FGFR1抑制会引起高磷酸盐血症，FGFR4抑制会引起腹泻——因此，在该家族内具有选择性的分子很有价值。FGFR4含有一个独特的活性位点半胱氨酸（Cys552），诺华的研究人员在开发roblitinib时利用了这一点。一项初步筛选发现了两种选择性结合Cys552的亲电体：芳基氯（通过SNAr反应不可逆地结合Cys552）和水杨醛（与Cys552形成可逆的半硫缩醛加合物）。随后的药物化学优化通过增加醛周围的位阻来增强代谢稳定性，这同时减缓了其还原为苄醇并增加了靶标亲和力。这些努力最终确定了roblitinib——一种强效的醛，在肝细胞癌小鼠异种移植模型中引起肿瘤体积的强烈减小。
选择性FGFR2抑制剂也是可取的，尽管由于P-环位点半胱氨酸的保守性以及家族内激酶结构域的高度同源性，开发起来也具有挑战性。Relay Therapeutics团队最近披露了一种独特的解决方案，他们利用分子动力学模拟来指导FGFR2选择性化合物的设计，这些化合物利用了FGFR1和FGFR2 P环之间的灵活性差异。他们发现，一组丙烯酰胺功能化的4-氨基吡咯并嘧啶与FGFR1和FGFR2均可逆地相互作用，但使FGFR1的P环稳定在丙烯酰胺无法触及Cys488的延伸构象中，而FGFR2中的等效环则采样更接近弹头的空间，从而提高了结合速率。进一步的优化将选择性窗口增强至256倍——创造了lirafugratinib，目前正在进行针对FGFR2改变的实体瘤的临床评估。
PI3Kα
磷酸肌醇3-激酶（PI3Ks）是一个蛋白质家族，它们磷酸化磷脂酰肌醇-(4,5)-二磷酸以形成磷脂酰肌醇-(3,4,5)-三磷酸——一种参与调节细胞生长和胰岛素信号传导的关键第二信使。这里关注的亚型PI3Kα，在受体酪氨酸激酶（RTK）/RAS/RAF信号级联下游发挥作用，并在PI3K/AKT/mTOR通路（调节凋亡和细胞周期的通路）中起着关键作用。因此，PI3Kα是一个重要的药物靶点，尽管在临床上具有挑战性，因为抑制会阻断胰岛素信号传导，可能引起靶点毒性。
尽管经常伴有严重的剂量限制性毒性，但共价泛PI3K抑制剂此前已被研究，目前正在进行临床评估。第一个被发现的泛PI3K抑制剂是真菌天然产物wortmannin，它通过涉及苯并呋喃-7-酮系统开环的机制结合催化性赖氨酸残基。Wortmannin仅作为化学工具使用，但一个更具选择性和12倍效力且药代动力学性质改善的衍生物（PX-866）在前列腺癌的临床试验中显示出适度的活性。
更多的兴趣集中在开发选择性PI3Kα抑制剂上。PI3Kα含有一个其他亚型中不存在的独特半胱氨酸（Cys862），可作为可能的选择性手柄。然而，与其他激酶靶点不同，Cys862远离活性位点（约10 Å），这构成了一个重大的药物化学挑战。目前报道的靶向Cys862的分子是通过将从可逆的、ATP竞争性抑制剂延伸出的连接体功能化，并在末端加上一个半胱氨酸反应性亲电体而开发的。采用这种策略的一个先导样分子于2013年报道，它对其他激酶表现出良好的选择性，并抑制了依赖于PI3Kα的细胞生长。
直接抑制PI3Kα的一个限制是相关的靶点剂量限制性高血糖——这是PI3Kα在胰岛素信号传导中发挥作用的结果。为了克服这些限制，最近的出版物报道了共价靶向p110α:RAS结合表面半胱氨酸（Cys242）的分子。这一策略的灵感来源于小鼠诱变研究，其中p110α-RAS结合域的突变破坏了RAS驱动的肿瘤发展。因此，一个能破坏RAS介导的PI3Kα激活的小分子可以在不引起高血糖的情况下破坏促增殖信号。已有两个分子采用这一策略出现——来自Vividion Therapeutics（VVD-159642，结构尚未披露）和Bridgebio Oncology Therapeutics（BBO-10203）。
这些项目披露了有希望的结果，支持RAS-p110α阻断策略。两者都抑制了下游Akt的磷酸化，并且在与KRASG12C抑制剂联合应用时引起了RAS驱动肿瘤的消退。结合观察到的有前景的抗肿瘤效果，VVD-844和BBO-10203均未引起高血糖，表明该策略避免了已知的PI3Kα抑制剂的靶点剂量限制效应。
Akt
Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，在PI3K/Akt/mTOR通路中于PI3Kα信号下游发挥作用。由于其调节细胞分裂和增殖的作用，Akt是一个有价值的药物靶点。2023年，可逆的、ATP竞争性的Akt抑制剂capivasertib在FDA获得批准。不幸的是，Akt抑制会导致严重的高血糖，因为Akt在胰岛素信号传导中发挥作用。
近期工作创建了一种可逆共价、突变体选择性的致癌性Akt E17K突变抑制剂。E17K突变通过逆转该位点的静电变化来改变Akt1活性，增强了对PIP2的亲和力。由于PIP2比PIP3丰富得多，E17K突变导致Akt1组成型激活并增强促增殖信号。因此，能够靶向Akt1E17K同时保留野生型蛋白的分子很有价值，并将避免与泛Akt抑制相关的许多剂量限制性副作用。
UCSF的Craven及其同事开发了一种创新方法来解决这个问题，他们开发了共价的、基于水杨醛的Akt1E17K抑制剂，直接靶向Lys17。在这里，X射线晶体结构指导了将非共价Akt1抑制剂功能化，连接一个可逆共价的、赖氨酸反应性水杨醛弹头。优化结合剂与弹头之间的连接体，创造了一种对Akt1E17K上的Lys17相对于其他赖氨酸残基具有高选择性，以及对Akt1E17K相对于野生型Akt1和Akt2具有选择性的化合物。
研究Akt1E17K-抑制剂的结合模式证明了加合物稳定性在控制可逆共价抑制剂选择性方面的重要性。共晶结构揭示了两个关键的稳定相互作用：锌离子、亚胺和邻位酚之间的新螯合作用，以及在无锌离子情况下，邻位酚与亚胺之间的氢键。这些相互作用预计会增加Lys17相对于其他竞争性亲核试剂的停留时间，在平衡时创造选择性。这项研究为优化可逆共价化合物时相关的不同设计原则提供了一个例子。对于不可逆共价化合物，只需要优化可逆结合模式和反应前的亲核试剂-弹头轨迹，而在可逆共价分子的设计中，结合后复合物的稳定性也很重要。这种基于水杨醛的抑制剂在体内结合了Akt1E17K，阻断了Akt1E17K信号传导，并在小鼠模型中缩小了Akt1E17K突变肿瘤——为AktE17K作为药物靶点提供了令人信服的支持。
转录因子
p53
肿瘤蛋白53（p53）是另一个已使用共价修饰剂靶向的癌症相关蛋白。它是一种转录因子，在应激（如DNA损伤、缺氧或营养缺乏）反应中，通过激活参与细胞周期停滞、DNA修复和凋亡的基因，阻止细胞传播基因组损伤。在非应激条件下，p53被负调节因子MDM2迅速泛素化和降解。p53的突变或功能丧失在许多癌症中很常见，使其成为一个有吸引力的药物靶点。然而，由于其作为转录因子的功能以及缺乏经典的、定义明确的结合口袋，p53长期以来被认为是“不可成药”的。
