引言
大酱是一种起源于中国东北的传统调味品，通过纯大豆和面粉发酵制成。它被认为具有降低胆固醇、血压以及抗癌等特性。传统制备方法往往缺乏严格的操作规程，导致品质不一。相比之下，工业化生产采用人工接种发酵，具有周期短、品质均一等特点，但可能影响其独特风味。近年来，为了丰富风味并赋予大酱特定功能特性，研究者们开发了添加其他原料的新产品。例如，有研究使用苦荞粉和大豆制作大豆酱，发现添加苦荞增加了总酸和总氨基酸氮含量，从而改善了整体风味。
花生在中国广泛种植，含有多种对人体代谢有益的活性成分。研究表明，食用花生与控制血压、降低心血管疾病风险、减少胆结石、肥胖、2型糖尿病和癌症发病率相关。花生蛋白质与鹰嘴豆和大豆更为相似。此外，花生因其独特风味和营养成分常被用于食品中。花生加工过程中产生的吡嗪和美拉德反应产物等化合物显著贡献了产品的风味。
风味是决定消费者接受度的主要因素，也是感官品质的关键指标。风味物质的形成相当复杂，受原料、微生物组成、发酵周期、环境因素和盐度等多种因素影响。本研究将花生引入大酱的制曲过程，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）和凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）进行人工接种，开发出一种具有更佳食用品质的新品种大酱。该产品解决了传统大酱风味单一的问题，并揭示了2,3,5-三甲基吡嗪、异戊醇等化合物是增强花生大豆酱风味的关键贡献者。
材料与方法
材料、试剂与设备
花生品种白沙和G965由辽宁正业花生生产产业发展有限公司提供。大豆原料、盐和面粉购自辽宁省沈阳市当地农贸市场。分析用化学品和溶剂为分析纯或高效液相色谱（HPLC）级。米曲霉、凝结芽孢杆菌和三氯乙酸购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国），而甲酸、甲酸铵和正己烷购自Sorabio（北京索莱宝科技有限公司）。
大酱和花生大豆酱的制备
将400克花生和1600克大豆用纯净水冲洗三次，然后浸泡12小时。去除花生红皮后，将其与大豆一起蒸熟并混合。随后加入300克面粉并充分混合。将混合物冷却至37°C，接种0.5%的混合菌（米曲霉和凝结芽孢杆菌，1:1），然后制成方块（20 × 10 × 6 cm），在32°C培养箱中培养28天，之后切成小块（2 × 1 × 1 cm）放入罐中。加入三倍于酱块体积的盐水，浓度达到12°Bé，随后每天搅拌100次，并在自然条件下发酵。相同工艺用于制作普通花生大豆酱（P）和高油酸花生大豆酱（G）。此方法也用于制备纯大豆酱（D），使用2000克大豆。
氨基酸氮含量的测定
采用酸碱滴定法测定发酵酱中的氨基酸氮（AAN）含量。
游离氨基酸的测定
样品预处理：向20 mg样品中加入141 μL水和100 μL 0.15% 十二烷基辛基碳酸酯，随后加入4 μL内标溶液（Lysine-d4/Tryptophan-d5/Glutamine-d4, 100 μg/mL）。混合物在40 kHz下超声处理10分钟，然后加入5 μL 10 M三氯乙酸，冷冻沉淀10分钟。离心（14,000 g，10分钟，4°C）后，收集25 μL上清液并加入375 μL水。混合物涡旋、过滤，收集上清液用于进一步分析。
色谱分析：使用Agilent AdvanceBio MS Spent Media色谱柱（2.1 × 50 mm，2.7 μm），柱温40°C，进样体积1 μL。流动相A为含0.1%甲酸和10 mM甲酸铵的95%水溶液，流动相B为含0.1%甲酸和10 mM甲酸铵的95%乙腈溶液。
质谱分析：使用QTRAP 6500+系统，正负离子模式，参数设置：气帘气35 psi，碰撞气中等，雾化气50 psi，辅助加热气50 psi，喷雾电压5500 V，离子源加热温度550°C。
感官品质分析
发酵过程中质地的测定
使用P25圆柱形探头和质构剖面分析（TPA）模式测定大酱发酵过程中的硬度和弹性。测量参数为：预测试速度2 mm/s，测试速度1 mm/s，返回速度1 mm/s，触发力0.07 N，目标值10 mm。
发酵过程中颜色的测定
色度计校准后，将适量均匀研磨的豆酱加入容器并铺于底部，置于色度计指定位置，盖上保护盖进行颜色测定。测量后，将样品分别旋转90°和180°继续测量，记录样品的L、a和b*值。
发酵过程中滋味的测定
将10克均匀研磨的样品溶解于蒸馏水中至100 mL。溶液在室温下静置2小时，然后以10000 rpm离心10分钟。上清液过滤后置于小烧杯中进行电子舌测试，评估酸味、苦味、鲜味、涩味、咸味、丰富度、后味-A（涩味后味）和后味-B（苦味后味）。
发酵过程中气味的测定
将10克样品放入50 mL离心管中，用塑料薄膜密封并盖紧。静置15分钟使气味均匀分散，然后将电子鼻针头插入管内进行测量。程序设置为传感器自清洁90秒，样品分析120秒，在系统相对稳定的117–119秒时获取结果。
风味化合物的代谢组学分析
样品制备
将约2.0克样品置于20 mL顶空瓶中，加入2.0 μL 100 μg/mL 正十五烷-d32，并立即密封顶空瓶。
HS-SPME-GC-MS分析
正构烷烃标准溶液的制备
将770 μL正己烷加入1.5 mL离心管中，依次加入适量C10–C25商业混合标样以及C26、C27、C28、C29和C30正构烷烃标样，涡旋混合得到C10–C30正构烷烃混合储备液（50 μg/mL）。
顶空固相微萃取（HS-SPME）
将2.0克样品放入20 mL顶空瓶，加入2.0 μL内标（正十五烷-d32，100 μg/mL），立即密封，随后在80°C平衡20分钟，纤维头在240°C老化5分钟，样品吸附20分钟，解吸2分钟。
GC-MS分析
质量控制
质量控制（QC）样品是P、G和D三种大酱的混合物，均接受相同处理。在检测过程中插入三个QC样品；QC样品的重复性反映了分析过程中仪器的稳定性，从而确保了结果的可靠性。
相对气味活度值（ROAV）计算
根据公式 ROAVi= (Ci/Ti) / (Cmax/Tmax) × 100 进行计算，其中Ci为组分的相对含量（%），Ti为组分的感官阈值（μg/kg），Cmax为对样品风味贡献最大的组分的相对含量（%），Tmax为对样品风味贡献最大的组分的感官阈值（μg/kg）。
数据分析
所有实验均进行三次重复。数据使用SPSS 27软件进行分析，以均值±标准差表示，并使用ANOVA进行比较。统计图和主成分分析使用Origin 2021进行。PEN3电子鼻软件WinMuster用于主成分分析和数据记录。挥发性风味化合物分析使用六次独立实验。创建搜索库后，使用补充、归一化和对数转换对矩阵文件进行预处理，以消除或减少可能的误差，并使用SPSS 27软件分析代谢物的相对丰度，以均值±标准差表示。
结果与分析
发酵过程中氨基酸氮含量的变化
AAN含量是衡量大酱品质的关键指标，它不仅反映大酱的成熟度，也反映其风味特征。如图所示，三种大酱的AAN含量随发酵时间延长而显著增加（p < 0.05），其中G组观察到的最高值为0.93 g/100 g，这与相关研究结果一致。
发酵过程中游离氨基酸含量的变化
游离氨基酸不仅是重要的风味物质，也是重要挥发性风味化合物的前体，其含量和类型直接影响食物的口感。同时，氨基酸的产生对大酱的成熟有显著贡献。特定氨基酸的比例也是大酱营养价值的重要指标。
如表1所示，三种大酱中游离氨基酸的含量随时间增加。在发酵第56天，相对于D组，添加花生的两个样品中丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量更高。精氨酸通常存在于花生中，可以调节血清胰岛素水平并减少肝脏中的胆固醇合成。
大酱的独特风味源于多种呈味氨基酸的协同作用，因此特定氨基酸的相对丰度直接影响大酱的风味和口感。根据风味可将氨基酸分为甜味、鲜味、苦味和无味四类。在P组中，这些风味相关氨基酸的含量排序为甜味 > 苦味 > 鲜味 > 无味。G和P组均含有较高的鲜味氨基酸。
三种大酱中必需氨基酸、非必需氨基酸和条件必需氨基酸的含量随发酵时间逐渐增加，含量排序为非必需氨基酸 > 必需氨基酸 > 条件必需氨基酸。根据联合国粮食及农业组织和世界卫生组织推荐的理想蛋白质模型，三个样品的E/N比值均高于0.6，E/T比值均高于0.4，表明三者均具有较高的营养价值。
感官品质分析
发酵过程中质地的变化
大酱的质地是影响消费者选择的重要因素。如表3所示，硬度随着发酵时间的延长逐渐降低，然后趋于稳定——具体而言，从初始值2.63 ± 0.26 N降至0.21 ± 0.02 N后进入稳定阶段。这是因为蛋白质、脂肪和碳水化合物被分解成更小的成分，使得大酱逐渐变软。弹性也随着发酵时间的延长而逐渐降低——具体而言，弹性值从初始的6.96 ± 0.19 mm降至1.87 ± 0.29 mm。这可能是因为在制曲过程中水分蒸发，导致酱块中的空隙变大。这可以解释为什么发酵初期弹性较高，随后随着翻动次数增加和发酵时间延长，酱块碎裂，弹性下降。随着发酵时间延长，粘附性逐渐降低——具体而言，粘附值从初始的1.24 ± 0.08 N降至0.12 ± 0.01 N。这可能是因为在发酵初期，酱块较大，盐水渗透不完全，导致酱块含水量低。咀嚼性反映了将半固态物质分解至可食用状态所需的能量。因此，P在发酵早期具有较大的咀嚼性（8.67 ± 0.67 N）。然而，受微生物代谢活动、外部盐水浓度和水分条件的影响，酱块硬度下降，导致粘附性降低。同样，随着时间的推移，D的内部结构也逐渐降解和分散，硬度和咀嚼性均降低。
发酵过程中滋味的变化
发酵过程中滋味的测定
如图所示，电子舌的传感器对不同发酵时间的大酱样品的滋味响应程度不同。观察到最强的信号对应于咸味、丰富度和鲜味，而酸味的信号最弱。P的滋味信号随着发酵期的延长而减弱。总之，发酵P的主要风味是鲜味、咸味和复合滋味，酸味、苦味和涩味减弱。
发酵过程中的主成分分析
主成分分析（PCA）图显示，PC1和PC2在三个样品中分别贡献了49.0%和35.3%。图显示，在PC1方面，G和D之间的距离相对较大，表明它们之间的滋味存在显著差异，而G与D有一定重叠，表明相似性更大。P和D之间没有重叠，表明滋味存在差异。因此，使用电子舌可以有效区分花生大豆酱和纯大豆酱。
发酵过程中气味的变化
发酵过程中雷达图分析
电子鼻传感器的雷达图显示了三个样品的整体气味响应。图中描绘的10个传感器对不同发酵时间的样品均有不同程度的响应。值得注意的是，四个传感器W5S、W1S、W1W和W2S的信号响应值显著且不同，表明样品在整个发酵过程中氮氧化物、甲基、硫化物、醇类、醛类和酮类的含量发生了显著变化。其余六个传感器的响应在发酵过程中略有重叠，表明这些传感器检测到的挥发性物质在过程中保持稳定，且组成基本相似。
三个样品电子鼻结果的主成分分析
如图所示，三个样品在PC1上显著分离，表明存在明显差异。在PC2方面，样品G和P紧密聚集，而两者均与样品D相距较远，表明添加花生的大酱在风味上具有相似性，且与纯大豆酱存在显著差异。PCA图清楚地显示三个样品之间没有重叠，区分度高，表明样品风味各异，且花生的加入对大酱的风味谱有显著影响。
三个样品电子鼻载荷图分析
载荷图的分析可以识别对Dajiang风味有显著影响的气味。在图中，第56天，W5S、W2S、W1S和W1W传感器对PC1的贡献最大，而W1W和W6S传感器对PC2的贡献显著。就各传感器的性能特征而言，PC1对氮氧化物、醇类、醛类、酮类、甲基和无机硫化物最敏感，而PC2对无机硫化物和氢化物敏感。
风味化合物的代谢组学分析
样品比较分析
非靶向代谢组学样品的结果如图所示，表明同组样品间具有很强的相关性。PCA1和PCA2的贡献率分别为23.1%和38.1%，总贡献率为61.2%。分析三个样品在PC1轴上的位置，发现P和G的成分相似，而它们与D之间存在显著差异。在PC2上，D和P的成分相似，但它们与G之间存在显著距离。图中可以明显看出三个样品有显著区分，表明它们之间存在显著差异。
大酱中代谢物的分析
三个样品中的代谢物
如图所示，在样品P、G和D中分别检测到42、40和34种代谢物。与D相比，花生的添加导致了更多被鉴定的代谢物。
三种样品共有31种代谢物，P和G之间有5种代谢物相同。P和D之间有一种代谢物相同，G和D之间有一种代谢物相同。在样品P中发现了五种独特的风味物质：2,5-二甲基吡嗪、苯甲腈、二苯甲酮、苯乙酸异戊酯和异丙醇。样品G中有三种独特的风味化合物：3-戊酮、1-甲基环戊醇和3-戊醇乙酸酯。D有一种独特的风味物质：苯亚甲基二乙酸酯。
为了进一步研究单个样品中代谢物的相对丰度，绘制了聚类热图（图）。热图清楚地区分了三种样品：P和G在代谢物丰度上高度相似且紧密聚集，而D与其他两组明显独立，表明其代谢物谱与其他两者存在显著差异。聚类结果进一步证实了代谢物在区分纯大豆酱和花生大豆酱方面的重要作用。
如表4和图10所示，酯类和醇类是两种最普遍的化合物，这意味着它们是大酱风味的主要贡献者。特定化合物的种类和浓度在三组样品中以不同程度变化。酯类化合物占总挥发性风味化合物的26.1%；它们在花生大豆酱中含量最高，赋予果香、甜香和酯类香气。例如，棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯具有果香。乙酯可用于监测大酱成熟的效果。醇类是大豆酱中第二丰富的挥发性化合物，贡献清新的果香和草本风味。苯乙醇具有玫瑰般的甜香，是酱油、醋和甜面酱等发酵豆制品中的关键芳香添加剂。在醇类组中，1-辛烯-3-醇、苏里尼醇（1-苯乙醇）和苯乙醇在D样品中含量更高。1-苯乙醇可用作食品调味剂和制药中间体。有研究称1-辛烯-3-醇是生大豆不良风味的原因。也有报道称1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征产物，与强烈的蘑菇气味有关。酸类占总挥发性风味化合物的6.5%；这些酸性化合物可以通过大豆酱中乳酸菌和酵母等微生物的发酵或酯分解产生。醛类占总挥发性风味化合物的8.7%，赋予坚果味、青草味和果香。它们可以通过发酵过程中的脂质氧化和降解产生。酮类和烃类各占总挥发性风味化合物的6.5%。酮类通常通过微生物发酵介导的脂质和氨基酸降解产生，有助于发酵食品的果味和榛子香气。风味谱显示，P和G中的含量比D更丰富。甲氧基苯酚是一种挥发性化合物，赋予发酵食品独特的烟熏味和酚类气味。2-戊基呋喃和2,3-二氢苯并呋喃通过热解产生，具有强烈的香气、甜味和烧焦气味。吡嗪是脂肪氧化和美拉德反应的产物，是大豆酱的特征。其含量可能受蒸煮条件、曲料比例、巴氏杀菌和豆酱陈化时间的影响。这些化合物具有烤土豆、炸花生和坚果的强烈香气。
