删除CRISPR阵列30.1增强生物膜形成并提高在大蜡螟模型中的毒力
在牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）ATCC 33277中删除CRISPR阵列30.1并未显著影响浮游细胞的生长，与野生型菌株相比，两者生长曲线在50小时内形状相似，均达到OD600为1.3的平台期。然而，对微孔板上生物膜形成的评估显示，ΔCRISPR阵列30.1突变株的生物膜生物量显著增加，通过藏红染色和492 nm光密度测量（野生型平均OD492值为0.165，突变株为0.185）进行量化。
为了直接评估CRISPR阵列30.1对细菌毒力的贡献，通过注射不同细菌浓度（107至108CFU/mL）感染大蜡螟幼虫。与野生型菌株相比，感染ΔCRISPR阵列30.1突变株的幼虫死亡率显著更高（P< 0.0001）。所有对照条件（生长培养基、热灭活野生型和热灭活突变株）在200小时观察期内均显示100%存活率。当细菌载量为6 × 108CFU/mL时，突变株在130小时内诱导了50%的幼虫死亡，而野生型菌株在200小时内的死亡率为38%。同样，在较低接种量（6 × 107和3 × 108CFU/mL）下，与野生型菌株相比，感染突变株的幼虫在200小时内的存活概率更高。对照幼虫在7天观察期内没有死亡（存活概率为1）。
CRISPR阵列30.1删除对THP-1细胞产生细胞因子和趋化因子的影响
评估了CRISPR区域删除对P. gingivalis细胞内代谢和宿主免疫反应的影响。使用经PMA处理的人单核细胞白血病细胞THP-1（一种巨噬细胞样细胞系），通过Luminex多重检测法测量感染后2小时和6小时细胞培养上清液中的细胞因子和趋化因子水平。巨噬细胞是牙周病病变中的关键炎症细胞，参与口腔骨丢失。THP-1细胞产生了稳健、可重复的反应，能清晰区分实验条件，并强烈转变为经典的炎症状态。这反映了体内观察到的现象：P. gingivalis招募并激活炎症巨噬细胞，其效应物输出（一氧化氮NO、促炎细胞因子和趋化因子）与感染负荷和骨吸收相关，从而验证了巨噬细胞作为这些反应实验的信息性宿主环境。
感染ΔCRISPR阵列30.1突变株导致IL-6、MIP-2α（CXCL2）、CXCL1和CXCL9的分泌显著增加。IL-6在6小时时，野生型（约83 pg/mL）与ΔCRISPR突变株（约110 pg/mL）之间增加了约32%。CXCL9在两个时间点比较中均显示出最强的统计学显著性，在6小时时变化倍数巨大（野生型：~0.05 pg/mL vs ΔCRISPR突变株：~1.8 pg/mL）。与2小时相比，显著性主要出现在6小时，表明THP-1巨噬细胞中存在转录扩增，与稳健的NFκB/MAPK激活以及CXCR3配体趋化因子程序的启动一致。到6小时，上游炎症信号（经典的是NFκB和MAPK）导致IL6和CXCL1/2产生并进入细胞培养上清液。CXCL9的上升表明CXCR3配体趋化因子轴（受STAT1/IRF/NFκB控制的CXCL9/10/11基因）被明确激活，该轴可招募CXCR3+效应细胞，如Th1 T淋巴细胞和巨噬细胞。
CXCL1和CXCL2主要招募中性粒细胞，而CXCL9主要吸引T细胞、自然杀伤（NK）细胞和树突状细胞到炎症部位。IL-10、IL-1α和IL-8（CXCL8）的水平也有所增加，但未达到统计学显著性。CXCL1在6小时时显示出最剧烈的增加（野生型约35 pg/mL vs ΔCRISPR突变株约240 pg/mL）。TNF-α显示出非常高的浓度（两种菌株均在~2,500–4,000 pg/mL范围内），但野生型和ΔCRISPR突变株之间没有明显的显著差异。
CRISPR阵列30.1删除对宿主-病原体转录组谱的影响
捕获THP-1细胞和细胞内P. gingivalis基因表达变化的双转录组分析揭示了广泛且具有定量显著性的通路改变，表明细菌和宿主细胞都发生了深刻的代谢重编程。基因参与的程度在不同通路间差异很大，由代表基因数量的点大小表示，一些通路包含大量基因集。
在每个时间点内，野生型和ΔCRISPR阵列30.1突变株的表达谱高度相似。相比之下，宿主细胞的转录谱受孵育持续时间的影响更大，2小时和6小时时间点之间的差异比由细菌菌株类型引起的差异更明显。
感染后2小时，核糖体通路在细菌细胞中显示出最高的倍数富集（约2.2–2.5倍），代表了最显著激活的通路，伴侣蛋白和折叠催化剂以及线粒体生物发生通路的激活也很显著。到6小时，核糖体功能仍然高度富集（约2.0倍），同时伴随氨酰-tRNA生物合成（约1.8倍富集）、转移RNA生物发生和转录机器的强烈激活，表明ΔCRISPR突变株中蛋白质合成机器的持续上调。ΔCRISPR突变株显示出关键代谢和生物合成通路的增强激活，包括核心代谢（三羧酸循环TCA、糖酵解/糖异生、丙酮酸和丁酸代谢）以及2小时和6小时的核苷酸和氨基酸合成通路。值得注意的是，在感染后2小时，观察到与分泌相关通路的独特激活（蛋白质输出、细菌分泌系统、群体感应和外膜囊泡形成）。
宿主细胞反应表现出更显著的定量变化，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路在2小时显示出最高的倍数富集（约5倍），其次是表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药通路（约4倍富集）。其他通路包括癌症中的蛋白聚糖、肌醇磷酸代谢和磷脂酰肌醇信号系统，根据log10(P)值均显示出显著的统计学激活。最引人注目的是，6小时的宿主反应显示百日咳通路具有极高的倍数富集（约8.5倍），代表了在所有条件和时间点中观察到的最剧烈的通路激活。碳水化合物代谢通路，包括果糖和甘露糖代谢以及核苷酸糖的生物合成，作为独特且独立的调控模块出现，整体规模达到高达9倍的富集。
网络分析揭示了通路富集未能捕捉到的额外复杂性层面。宿主通路网络展示了免疫信号、代谢调控和细胞过程之间广泛的相互联系，通过颜色编码清晰地划分了时间特异性：紫色点代表2小时特异性通路，蓝色点代表6小时特异性反应，黄色点代表常见通路，并叠加了上调（绿色）和下调（红色）的基因表达模式。中枢通路作为具有多个连接的主要节点出现，尤其是在免疫信号簇内，表明跨生物过程的协调调控控制。宿主THP-1细胞在两个时间点均显示出核因子κB（NF-κB）信号和血小板激活的激活。在2小时，涉及免疫信号（B细胞受体信号、Fcγ受体介导的吞噬作用）、磷脂信号、细胞内钙动员、生长因子信号（EGFR抑制剂耐药、Ras信号）、脂肪酸调节（PPAR信号）和破骨细胞分化的宿主通路被高度激活。在6小时，碳水化合物代谢和免疫调节通路（氨基糖代谢、核苷酸糖合成和百日咳宿主-病原体相互作用）占主导地位。
细菌基因网络呈现了更全面的图景，数百个单个基因被映射到特定通路，揭示了这是大规模的代谢重编程，而非适度的通路调整。基因调控模式显示通路簇内存在协调的上调（绿色）和下調（紅色），相关代谢通路（例如，核糖体簇、氨基酸代谢簇）聚集在一起。细菌网络的密度和复杂性超过了宿主反应，表明CRISPR阵列删除触发了广泛的细菌转录重组。与疾病相关的通路，包括与新型冠状病毒肺炎（COVID-19）和癌症相关的通路，出现在宿主网络中，但原始文本未加阐述，这暗示了病原体-宿主相互作用在疾病背景下的更广泛意义。这种网络层面的分析表明，ΔCRISPR突变株协调了跨多个生物过程的调控，代表了细菌生理学和宿主-病原体动力学的基本转变，而非孤立的通路改变。
通过单引物扩增（SPA）鉴定CRISPR阵列30.1间隔子的基因组靶标
为了进一步阐明CRISPR间隔子调控细菌代谢的机制，我们使用CRISPR阵列30.1的119个单个间隔子作为引物，对ΔCRISPR阵列30.1突变株的基因组DNA进行了单引物扩增。我们对扩增产物进行了测序和定位，以揭示特定的基因组靶标。当我们使用野生型基因组DNA作为阳性对照时，我们主要扩增了CRISPR阵列30.1区域本身。正如预期，覆盖度谱图显示了使用野生型DNA作为对照时的预期扩增模式。
SPA产生了两种不同的扩增模式：真正的特异性结合和非特异性结合，后者以多样化的PCR产物为特征。总体而言，119个间隔子中的41个（109个引物）产生了特异性的PCR产物，而68个间隔子产生了非特异性结合模式。SPA靶标分布在全基因组范围，包括基因编码区和基因间区。SPA结果显示，靶标分布在整个环形染色体上，而非聚集分布。靶向的基因包括参与膜转运（硫酸盐通透酶、镁转运蛋白、转运蛋白、含转运蛋白底物结合域蛋白和ABC-F家族ATP结合盒域蛋白）、DNA复制、修复和修饰（切除核酸酶ABC亚基UvrA、位点特异性DNA甲基转移酶、RecQ家族ATP依赖性DNA解旋酶和含UvrD-解旋酶域蛋白）、辅因子和维生素生物合成（钴(I)啉酸a,c-二酰胺腺苷转移酶[钴胺素生物合成]、硫辛酸合酶、硒化物和水双激酶SelD[硒代谢]）、接合和移动遗传元件（接合转座子蛋白TraK、接合转移蛋白MobC和IS5家族转座酶）、磷酸酶和水解酶（磷酸酶PAP2家族蛋白、碱性磷酸酶家族蛋白、MBL折叠金属水解酶）、核心代谢和能量（延胡索酸还原酶/琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基、醛脱氢酶家族蛋白、NAD(P)依赖性氧化还原酶）、蛋白质合成和加工（甲硫氨酰-tRNA连接酶、延伸因子G、RsiV家族蛋白、S46家族肽酶、脯氨酰寡肽酶家族丝氨酸肽酶、信号肽酶I）、转录调控（螺旋-转角-螺旋转录调节因子、反应调节转录因子）以及CRISPR-Cas系统（VI-B型CRISPR相关RNA引导的核糖核酸酶Cas13b）的基因。
此外，还在关键操纵子上游的基因间区发现了几个靶标，更侧重于移动遗传元件（多个转座酶）、蛋白质加工机制和转运系统。多个插入序列（IS）元件的存在表明这些间隔子可能靶向与基因组不稳定性或水平基因转移事件相关的区域。
富集分析揭示了间隔子靶向的特定定量模式，表明了对关键细胞过程的精确调控重点。最显著富集的功能类别是硒化合物代谢过程，在百分比尺度上显示出超过100个基因/项的富集水平，其次是钴胺素生物合成过程和多个DNA相关过程的实质性富集，具有不同但显著的富集水平。然而，在分析靶向功能的分布比例时，tRNA修饰成为主要类别，占所有间隔子靶标的29.41%，其次是翻译延伸占14.71%。这表明近一半的CRISPR间隔子靶标集中在蛋白质合成机制上。其他功能类别显示出更温和但显著的占比：蛋白水解、缬氨酰-tRNA氨酰化和DNA模板转录的调控各占靶标的8.82%，而硒化合物代谢过程、钴胺素生物合成过程和镁离子转运各占总数的5.88%。最特异的调控靶标，DNA转座和DNA复制调控，各占间隔子靶标的2.94%。这种定量分布揭示，CRISPR阵列30.1间隔子主要靶向翻译机制（tRNA修饰和翻译延伸合计占靶标超过44%），表明主要的调控机制涉及微调蛋白质合成能力和效率，而非广泛的代谢控制，次要重点是蛋白水解过程和转录调控。
这项研究确定了牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277中不编码的CRISPR阵列30.1先前未被认识的调控功能，确立了其作为细菌生理学和宿主-病原体相互作用的全局调节因子。删除CRISPR阵列30.1导致了细菌转录组的实质性变化，包括增强的代谢和分泌通路、增加的生物膜形成、在大蜡螟感染模型中加速的毒力以及THP-1巨噬细胞中增强的促炎细胞因子反应。这些发现拓展了CRISPR-Cas系统在核酸靶向免疫之外的功能范围，强调了其作为细菌毒力核心调节因子的潜力。
虽然自身靶向间隔子在多种细菌物种中都有记载，但其精确的调控作用在很大程度上仍是推测性的。我们的结果提供了间隔子介导的内源基因抑制的直接证据，正如通过SPA将CRISPR阵列30.1间隔子定位到自身基因组靶标所证明的那样。这种调控模型与其他细菌中观察到的机制一致，例如在土拉热杆菌（Francisella novicida）中，Cas9介导的转录干扰利用小CRISPR相关RNA（scaRNA）来调节内源基因表达。在牙龈卟啉单胞菌中，间隔子-靶标相互作用显著涉及对生物膜发展和细胞内生存至关重要的基因，如营养获取、表面修饰和分泌相关的基因。
在ΔCRISPR 30.1突变株中观察到的增强的生物膜形成支持了CRISPR阵列30.1负调控生物膜相关基因的观点，可能促进细菌从生物膜生长向宿主细胞入侵的转变。生物膜使牙龈卟啉单胞菌能够在动态环境条件（包括口腔腔典型的波动氧气和营养水平）下持续存在。我们的发现扩展了先前的报告，这些报告证明了I-B型CRISPR-Cas系统对牙龈卟啉单胞菌毒力所必需的新型粘附素的调控。
时间动态揭示了宿主-病原体相互作用中不同的调控阶段，细菌反应在感染THP-1细胞后2小时和6小时均显示出持续的代谢上调，而宿主反应则表现出时间依赖性通路转换。在2小时，宿主细胞激活了生长因子信号（EGFR抑制剂耐药）和脂质代谢（通过PPAR信号），表明对细菌入侵的初始代谢适应。已知牙龈卟啉单胞菌通过信号通路（包括PPAR激活）操纵巨噬细胞的炎症反应。到6小时，反应转向碳水化合物代谢和免疫调节通路，特别是与百日咳相关的反应，表明从代谢适应向主动抗菌防御的转变。这种时间进程表明，CRISPR阵列30.1的删除不仅解除了对细菌的代谢限制，还破坏了宿主-病原体平衡的正常动力学，导致加速的炎症激活和细菌典型免疫逃逸能力的丧失。
SPA分析鉴定了CRISPR阵列30.1间隔子对全基因组的自身靶向，包括关键操纵子上游的基因和基因间区。与基于应激反应通路的预期相反，tRNA修饰成为主要的靶向类别，占所有间隔子靶标的29.41%，其次是翻译延伸占14.71%。这两个类别合计占对蛋白质合成机制调控重点的44%以上。这种定量分布直接解释了观察到的核糖体通路富集，在间隔子靶向和转录组结果之间建立了清晰的机制联系。硒代谢在靶向通路中显示出最高的统计学富集，表明CRISPR阵列30.1特异性地限制了硒依赖过程，这对于牙周环境中的厌氧代谢和氧化应激反应可能至关重要。硒以硒代半胱氨酸的形式掺入硒蛋白中，对细菌的各种生理功能（包括氧化还原稳态和抗氧化防御）至关重要。
值得注意的是，我们观察到间隔子介导的对VI-B型系统cas基因座的靶向，表明对CRISPR免疫的自我调控以及不同CRISPR-Cas系统之间的串扰。系统间相互作用已有记载，例如在柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）中，VI-B型系统从II-C型系统捕获间隔子，从噬菌体和宿主基因组DNA中获取间隔子。类似地，在沙雷氏菌（Serratia）中，I型和III型系统合作共享间隔子，增强了整体细菌免疫力。
我们研究中确定的靶标还包括关键的应激反应和DNA修复基因，如UvrA、UvrD和RecQ解旋酶。UvrA通过识别DNA损伤并招募修复复合体来启动核苷酸切除修复（NER）。UvrD解旋酶在损伤识别后解开DNA链，促进修复，而RecQ解旋酶有助于同源重组和DNA损伤处理。这些发现暗示了这些蛋白质在牙龈卟啉单胞菌应激管理和基因组稳定性中的保守作用。
此外，已鉴定的间隔子靶标包括与厌氧代谢适应相关的基因和操纵子，特别是钴胺素（维生素B12）生物合成通路，这在炎症相关牙周病期间普遍存在的营养应激条件下至关重要。CRISPR对钴胺素合成通路的调控可能直接影响毒力，特别是通过调节牙龈蛋白酶（一种与组织破坏和免疫逃逸相关的强效毒力因子）。另外，CRISPR间隔子靶向调控蛋白，包括AraC家族转录调节因子。AraC样蛋白是牙龈卟啉单胞菌中重要的调控元件，通过响应环境信号（特别是与表面结构如菌毛相关的信号）来调节基因表达，从而在细菌的适应性和毒力中扮演关键角色。牙龈卟啉单胞菌菌毛的产生受到由FimS和FimR组成的双组分调节系统的明确控制。这种相互作用体现了环境感应和转录适应的概念，宿主对牙龈卟啉单胞菌的反应等因素意味着调控行为的动态相互作用，共同控制致病性。
值得注意的是，关于血红素可用性触发的DNA甲基化和基因表达变化的新见解突显了牙龈卟啉单胞菌中复杂的调控层次。已经鉴定了差异DNA甲基化特征，这对于理解基因表达如何受营养线索调控至关重要，表明甲基化过程可能与AraC等调控蛋白交织在一起。这表明AraC家族蛋白可能是更广泛调控网络的一部分，不仅响应直接的环境刺激，还响应影响基因表达的表观遗传变化。通过靶向这些调节因子，CRISPR阵列可能协调对环境应激源和宿主免疫挑战的反应。牙龈卟啉单胞菌以其逃避先天免疫的能力而闻名，抑制趋化因子（如IL-8）以抑制中性粒细胞募集并操纵宿主炎症反应。
CRISPR阵列30.1的缺失逆转了免疫逃避，放大了THP-1巨噬细胞促炎介质（IL6、IL8、TNFα、CXCL1、CXCL2）的分泌，并导致CXCL9的显著上升（约36倍）。CXCL9是一种干扰素γ（IFNγ）应答的CXCR3配体，预计将招募效应T细胞和NK细胞，并使反应偏向Th1/M1轴，而IL6与CXCL1/CXCL2一起升高则强化了与破骨细胞生成和骨吸收相关的富含中性粒细胞的急性炎症环境。显著性主要出现在6小时，与通过NFκB/MAPK（针对IL6/CXCL1/2）和STAT1/IRF1应答程序（针对CXCL9）的转录扩增一致。综上所述，IL6和CXCL9特征表明，CRISPR阵列30.1的缺失增强了巨噬细胞的感应，并将宿主反应转向中性粒细胞和CXCR3介导的炎症程序。CRISPR阵列30.1依赖的MAPK/ERK和JAK/STAT通路调控可能与牙龈卟啉单胞菌感染的上皮细胞中报告的致癌过程相交。
有趣的是，TNF-α在野生型和突变株之间没有显著差异。未来剖析单个间隔子-靶标对的研究对于阐明CRISPR介导的分泌型毒力因子调控如何影响宿主-病原体动力学至关重要。
我们的发现与转座子测序数据互为补充，这些数据证明了I型、III型和VI型Cas系统在上皮定植和体内脓肿形成中的重要作用。这些结果强烈表明，牙龈卟啉单胞菌利用多种CRISPR系统（包括不编码的阵列）来微调其致病策略。
这项研究使用了THP-1巨噬细胞样细胞和大蜡螟感染模型，虽然稳健且信息丰富，但并未完全复制人类牙周病。尽管SPA有效地鉴定了间隔子靶标，但转录抑制的决定性证据还需要额外的靶向报告基因或CRISPR干扰（CRISPRi）实验。未来的研究将侧重于测试CRISPR阵列30.1与UvrA基因之间的相互作用，因为后者在DNA修复和应激反应通路中具有重要作用。这种靶向方法将为后续实验提供信息，并阐明该过程中涉及的调控机制。
本文提出的结果显著增强了我们对牙龈卟啉单胞菌如何利用CRISPR-Cas系统操纵宿主免疫反应的理解。值得注意的是，CRISPR阵列30.1的缺失导致炎症细胞因子释放的放大和支持巨噬细胞极化转变的基因表达谱，标志着促炎反应的增强，这可能破坏宿主防御机制与病原体持久性之间的平衡。这种对免疫信号的操纵是牙龈卟啉单胞菌致病性的一个标志，并暗示了CRISPR介导的调控在免疫调节中更广泛的作用。其他口腔病原体也报告了CRISPR类似的免疫调节功能。因此，缺失cas3基因的变形链球菌（S. mutans）UA159菌株不仅显示出胞外多糖（EPS）产生和生物膜形成减少，而且对氟化物的敏感性增加。此外，口腔病原体可能利用CRISPR-Cas来调节微生物-微生物相互作用。福赛坦氏菌（T. forsythia）的间隔子与牙龈卟啉单胞菌（例如，甲基转移酶基因）和齿垢密螺旋体（T. denticola）的基因具有显著的核苷酸相似性。作者提出，牙龈卟啉单胞菌可能将其DNA递送到其他物种的细胞中以建立生态位优势，而福赛坦氏菌则通过将其CRISPR-Cas系统的间隔子和Cas蛋白递送到牙龈卟啉单胞菌细胞中来攻击其甲基转移酶基因，以影响其持久性。
未来的研究应通过CRISPR阵列内的靶向编辑或间隔子交换来探索单个间隔子-靶标相互作用。最后，小分子抑制剂或反义寡核苷酸等破坏间隔子-靶标相互作用的治疗方法为新型抗菌策略提供了令人兴奋的机会。通过证明不编码的CRISPR阵列作为毒力和宿主相互作用的主调节因子发挥作用，我们的发现显著扩展了当前对CRISPR生物学的理解，并揭示了针对细菌病原体的治疗干预新途径。
