引言
在硬骨鱼中，鳍条（fin rays）呈现出丰富的形态和结构多样性。其中，鲤形目（Cypriniformes）鱼类通常仅有软鳍条（soft rays），而棘鳍鱼（Acanthomorphs）的背鳍和臀鳍前部则进化出了作为防御机制的棘状鳍条（spiny rays）。软鳍条的特征包括由膜内成骨（intramembranous ossification）形成的骨节（bone segments）、分隔骨节的纤维关节、分叉（bifurcations）以及远端的类肌动纤维束。相比之下，棘状鳍条缺少关节和分叉，更短、更厚，前端的两个半鳍条（hemiray）常融合，且骨化程度更高。
Hox基因家族编码高度保守的同源域转录因子，在脊椎动物身体模式（body patterning）形成中发挥核心作用。在斑马鱼中，由于古老的基因组复制事件，存在七个Hox基因簇。其中，hoxa13a、hoxa13b和hoxd13a已被证明对胸鳍内骨骼（endoskeleton）的图案形成至关重要。先前研究表明，在棘鳍鱼Astatotilapia burtoni的发育过程中，其后部软鳍条区域特异表达hoxa13基因，而前部棘状鳍条区域则缺乏hoxa13表达，转而表达alx4a。这提示Hox13基因表达的差异可能与软鳍条和棘状鳍条的不同命运决定有关。
结果
Hoxa13a、Hoxa13b和Hoxd13a对鳍条表型的组合贡献
本研究利用CRISPR-Cas9技术，在斑马鱼中诱导了hoxa13a、hoxa13b和hoxd13a基因的缺失突变，并培育出稳定的三重纯合突变体（hoxa13a-/-, hoxa13b-/-, hoxd13a-/-），以及多种双纯合/单杂合的复合突变体。
对三重突变体的分析显示，其鳍条结构在所有鳍中（除尾鳍外）均受到严重影响。与野生型相比，突变体的鳍条显著变短、变厚，完全丧失了关节、分叉和末端类肌动纤维。尤其以成对鳍（胸鳍和腹鳍）的长度缩减最为严重。然而，尾鳍的表型相对温和，仅出现约25%的长度缩减和偶尔的关节间距异常，但关节、分叉和类肌动纤维（除最外侧鳍条外）基本得以保留。
鳍条和远端辐状骨（distal radials）的数量也发生了变化。例如，在三重突变体中，胸鳍的远端辐状骨数量从野生型的7个增加到10个；腹鳍的鳍条数量则从7条减少到5条；背鳍和臀鳍的鳍条和辐状骨数量也时有减少，但并非完全外显。
Hoxa13a、Hoxa13b和Hoxd13a对鳍条缺陷表型的差异贡献
通过分析不同基因组合的复合突变体，研究者评估了各个hox13基因对正常软鳍条形成的相对重要性。
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在hoxa13a-/+, a13b-/-, d13a-/-和 hoxa13a-/-, a13b-/+, d13a-/-突变体中，所有鳍的关节、分叉和类肌动纤维均正常存在。
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然而，在hoxa13a-/-, a13b-/-, d13a-/+突变体中，除了尾鳍，其他所有鳍都丧失了关节、分叉和类肌动纤维，表型与三重突变体相似。仅保留一个hoxd13a野生型等位基因不足以挽救这些结构。
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当hoxd13a拥有两个野生型拷贝（即hoxa13a-/-, a13b-/-, d13a+/+）时，虽然关节间距不规则，但背鳍和臀鳍的关节和分叉得以恢复；不过，成对鳍中这些结构仍然缺失。
这些结果表明，hoxa13a和hoxa13b对于背鳍、臀鳍和成对鳍中软鳍条核心结构特征的形成比hoxd13a更为关键。单个hoxa13a或hoxa13b野生型等位基因就足以确保所有鳍类型中这些结构的正常形成。
三重纯合Hox13突变体鳍条与棘鳍鱼棘状鳍条的表型相似性
为了探究突变体鳍条与棘状鳍条的相似性，研究团队对三重突变体、野生型斑马鱼以及棘鳍鱼Melanochromis auratus进行了骨骼茜素红染色和显微CT分析。
结果证实，三重突变体的鳍条在多个方面与棘鳍鱼的棘状鳍条相似：它们缺乏关节和分叉，长度较短，并且半鳍条的骨组织明显增厚。显微CT扫描定量分析显示，在沿鳍条近-远轴（proximal-distal axis）的特定位置，突变体半鳍条的骨厚度是野生型的2到2.5倍。
然而，突变体鳍条与真正的棘状鳍条也存在差异。例如，突变体的两个半鳍条在尖端并未像棘状鳍条那样融合；突变体鳍条末端完全缺乏类肌动纤维，而棘状鳍条的类肌动纤维则以不同的方式排列在鳍条后侧。这表明突变体表现出的是不完全的“棘状化”转变。
三重Hox13突变体中alx4a和grem1b表达模式的变化
先前在棘鳍鱼中的研究表明，grem1b在软鳍条区域特异性表达，而alx4a则在棘状鳍条区域表达。为了探究hox13基因缺失是否导致了类似的分子模式变化，研究者对斑马鱼幼虫背鳍和臀鳍原基进行了基因表达分析。
在野生型斑马鱼中，alx4a仅在前部原基表达，而grem1b在后部原基表达。在三重突变体中，尽管原基本身尺寸减小，但alx4a的表达域相对于原基大小有所扩张。更重要的是，grem1b的表达在突变体背鳍和臀鳍原基中显著下调。这些表达变化与在棘鳍鱼中观察到的软鳍条与棘状鳍条区域的差异具有相似性，提示斑马鱼中的Hox13因子可能作为grem1b的上游调控因子。
讨论
本研究揭示了hoxa13a、hoxa13b和hoxd13a在斑马鱼成年鳍条图案形成中的关键作用。其中，hoxa13a和hoxa13b比hoxd13a对背鳍、臀鳍和成对鳍的正常软鳍条形成更为重要。基因表达数据也支持这一结论，例如在斑马鱼尾鳍远端，hoxa13b的表达水平远高于hoxd13a。
一个有趣的现象是，尾鳍在所有突变基因型中均表现出最轻微的表型缺陷。这可能是由于尾鳍对游泳至关重要，存在更强的遗传补偿机制以维持其结构。此外，也可能存在不同的调控基因，如hoxc13和hoxb13，它们对尾鳍发育更为关键。
本研究的核心发现是，三重hox13突变导致斑马鱼的背鳍、臀鳍和成对鳍的软鳍条发生了向棘状鳍条样结构的部分转变（partial transformation）。这种转变在形态上表现为关节、分叉和类肌动纤维的缺失，以及骨厚度的增加。在分子层面，突变体原基中grem1b的下调和alx4a表达域的扩张，与棘鳍鱼中区分软鳍条和棘状鳍条域的基因表达模式变化相呼应。
然而，这种转变并不完全。突变体鳍条缺乏真正的棘状鳍条所具有的半鳍条前端融合特征，且alx4a的表达并未像在棘鳍鱼中那样占据整个棘状鳍条域。这表明，hox13基因的缺失可能是软鳍条向棘状鳍条进化转变过程中的一个重要步骤，但并非唯一因素，后续可能还需要其他遗传修饰才能实现完整的形态转变。
从进化发育生物学（Evo-Devo）的角度看，Hox基因的突变常导致同源异型转变（homeotic transformation）。本研究的结果提示，hox13基因表达的丧失，以及随之而来的grem1b表达下调，可能在棘鳍鱼进化过程中软鳍条向棘状鳍条的转变中扮演了关键角色。
方法
本研究遵循了渥太华大学的动物伦理政策，所有实验程序均经动物护理委员会批准。研究使用CRISPR-Cas9技术诱导了斑马鱼hoxa13a、hoxa13b和hoxd13a基因的缺失突变，并通过连续杂交获得了一系列复合突变体品系。通过活体成像、骨骼染色、显微CT扫描、整体原位杂交以及杂交链式反应（HCR）RNA荧光原位杂交等技术，对突变体的形态表型、骨骼结构和基因表达模式进行了系统分析。所有统计数据均使用SPSS Statistics和Microsoft Excel进行处理和图表生成。
