提升mRNA-LNP疫苗稳定性：冻干工艺优化与长期贮存可行性研究

本文聚焦mRNA-LNP疫苗的稳定性瓶颈，探讨了通过优化冻干工艺（包括筛选辅料和缓冲液）来开发在非冷冻温度下长期保存的固体剂型的可行性。研究表明，含20%蔗糖/海藻糖与Tris/组氨酸缓冲液的配方在4°C下可稳定4个月，其中蔗糖/Tris配方在20°C下也能保持可接受稳定性。这为突破冷链限制、实现mRNA药物产品的全球可及性提供了关键依据。

mRNA-LNPs（脂质纳米颗粒包裹的信使核糖核酸）作为一种革命性的疫苗和药物递送平台，在新冠疫情防控中展现出巨大潜力。然而，其核心的mRNA分子和LNPs递送系统固有的稳定性差，是阻碍其大规模分发、特别是向资源匮乏地区普及的关键瓶颈。当前许多mRNA疫苗（如辉瑞和莫德纳的COVID-19疫苗）需要苛刻的超低温（-70°C或-20°C）储存和运输条件。因此，开发不依赖严格冷链的稳定制剂成为紧迫需求。本研究旨在通过优化冻干（冷冻干燥）工艺，将液态mRNA-LNPs转化为固态粉末，探究其在非冷冻温度下长期保存的可行性。

2. 材料与方法

研究使用购自TriLink Technologies的加帽mCherry-mRNA转录本。通过手动注射器混合法，将乙醇脂质相（包含离子化脂质ALC-0315、DSPC、胆固醇和PEG-脂质ALC-0159）与mRNA醋酸钠水溶液混合，以10:1的脂质与mRNA重量比进行封装，形成mRNA-LNPs。随后用5 mM Tris缓冲液（pH 8.0）进行透析以去除乙醇。

在冻干工艺开发中，研究团队首先对多种辅料和缓冲液组合进行了初步筛选。辅料包括两种糖类（蔗糖、海藻糖）、一种糖醇（甘露醇）和一种蛋白质类冻干保护剂（明胶）；缓冲液则选用Tris、组氨酸和PBS。目标是评估它们在冻干过程中对mRNA-LNPs物理化学性质（粒径、多分散指数PDI和封装效率EE%）的保护效果。基于初步结果，筛选出四个最优配方用于后续长期稳定性研究：F1（20%蔗糖 + 5 mM Tris）、F2（20%蔗糖 + 5 mM 组氨酸）、F3（20%海藻糖 + 5 mM Tris）、F4（20%海藻糖 + 5 mM 组氨酸）。冻干过程在Virtis Advantage Pro冻干机中进行，具体参数包括：在-50°C冷冻5小时，随后在-30°C进行初级干燥5小时，最后进行1小时的二级干燥并逐步升温。

为评估长期稳定性，将冻干后的样品置于不同温度（-80°C、-20°C、4°C和20°C）下储存长达6个月。在特定时间点，将冻干饼块用无RNA水复溶，并对其物理化学性质和功能活性进行表征。物理化学表征包括：使用动态光散射法（DLS）测定粒径和PDI；使用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒通过荧光法测定封装效率（EE%）；使用Agilent 2100生物分析仪通过毛细管电泳评估mRNA完整性。功能活性则通过体外转染实验评估：用冻干复溶后的mRNA-LNPs转染HEK-293细胞，培养24小时后，通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白（mCherry）的表达，以定性评估转染效率，并使用ImageJ软件进行定量图像分析以计算转染效率。

3. 结果

3.1. 辅料的初步筛选

初步筛选结果表明，缓冲液和辅料类型对冻干后mRNA-LNPs的稳定性至关重要。在不含任何保护剂的对照组中，冻干导致LNPs严重失稳，封装效率接近于零。在三种缓冲液中，5 mM Tris和10 mM 组氨酸缓冲液表现优异，与蔗糖或海藻糖组合时，能保持高达95%的封装效率。而PBS缓冲液则表现不佳，通常导致封装效率显著降低、粒径增大。

在辅料方面，糖类（蔗糖和海藻糖）的保护效果优于糖醇（甘露醇）和蛋白质（明胶）。20%浓度的蔗糖或海藻糖与Tris或组氨酸缓冲液组合，能最佳地保持较小的粒径（约200 nm）、较低的PDI（<0.2）和较高的封装效率（>90%）。相反，甘露醇和明胶，尤其是与PBS组合时，会导致封装效率大幅下降（损失20%-90%）、粒径增大和PDI升高。毛细管电泳分析进一步证实，四个优选配方（F1-F4）在冻干后均能很好地保持mRNA的完整性，显示出一个与新鲜制备样品相似的、占主导地位的1000 nt全长mRNA峰。

3.2. 长期稳定性研究

长期稳定性研究揭示了温度对冻干mRNA-LNPs保存效果的显著影响。

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  在超低温（-80°C和-20°C）下：所有四个优选配方（F1-F4）在长达6个月的储存期内都表现出优异的稳定性。其粒径、PDI和封装效率均保持在与冻干初期相近的水平，封装效率维持在90%以上。这表明在超低温下，辅料优化的冻干制剂能长期保持其物理化学完整性。
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  在冷藏温度（4°C）下：配方F1、F2和F3在6个月的储存期内表现出良好的稳定性，能维持较小的粒径、较低的PDI和较高的封装效率。体外转染实验显示，F1、F3和F4配方在4°C下储存4个月后，仍能诱导强烈的荧光信号，表明其功能性mRNA活性得以保持。而F2配方在4个月时荧光信号减弱，对照组（未冻干液体）则在4个月后完全失去活性。这凸显了优化配方在延长冷藏条件下功能性保质期方面的关键作用。
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  在室温（20°C）下：所有样品的稳定性均面临挑战。尽管冻干配方（F1-F4）在最初3个月内比对照组更能保持粒径和PDI，但随着时间的推移，所有配方都出现粒径增大、PDI升高和封装效率显著下降的情况。到第6个月时，冻干配方的封装效率降至40%-60%，而对照组则低于20%。体外转染结果更为严峻：仅在F1（20%蔗糖 + 5 mM Tris）配方中，在20°C下储存4个月后仍能检测到较强的荧光信号；其他配方（F2-F4）和对照组在1-2个月内活性即大幅下降或消失。这表明即使在优化后，长期室温储存对mRNA-LNPs而言仍是一大难题，而F1配方是其中表现最为稳健的。

4. 讨论

本研究深入探讨了冻干工艺中影响mRNA-LNPs稳定性的关键因素及作用机制。

冻干过程本身会对LNPs施加多种应力，如冰晶形成、脱水和复溶过程中的物理化学扰动，可能导致颗粒聚集、融合和mRNA泄漏。本研究中观察到的某些配方冻干后粒径增大和PDI升高与此相符。

辅料，特别是糖类，通过多种机制发挥保护作用。蔗糖和海藻糖能形成无定形的玻璃态基质，将mRNA和脂质成分固定化，限制分子流动性，从而抑制水解、氧化反应和纳米颗粒的聚集融合。它们还能通过氢键与脂质双分子层的极性头部和RNA的磷酸骨架结合，在脱水阶段替代水分子，维持LNPs的天然结构。相比之下，甘露醇易结晶，明胶则可能形成较大且不均一的颗粒，保护效果有限。

缓冲液的选择同样关键。Tris和组氨酸缓冲液能有效调节冻干过程中的pH和离子强度变化，维持LNPs的稳定性。Tris还具有清除自由基的能力。而PBS因其较高的离子强度以及在温度变化中可能发生的显著pH波动，容易破坏脂质层结构，导致稳定性下降。

长期储存的结果印证了温度的核心影响。在-80°C和-20°C下，所有降解过程近乎停止，因此即使没有辅料，对照组也能保持一定稳定性，而优化配方则表现更佳。在4°C下，优化配方形成的玻璃态基质仍能有效减缓降解，维持数月的稳定性。然而，在20°C下，残留水分增加、分子流动性增强，导致保护性玻璃态基质的有效性降低，脂质氧化和水解加速，使得长期室温储存极具挑战性。本研究的亮点在于，首次将高浓度（20%）的蔗糖/海藻糖与组氨酸缓冲液组合引入冻干配方库，并证实了蔗糖/Tris（F1）配方在相对苛刻条件下的突出稳健性。

5. 结论

本研究证实，通过精心筛选辅料（特别是蔗糖和海藻糖）和缓冲液（Tris和组氨酸），可以成功开发出能在冻干过程中和后续长期储存中保持稳定的mRNA-LNPs固体配方。优化后的冻干制剂在-80°C、-20°C和4°C下可保持长达6个月的物理化学和功能活性，其中蔗糖/Tris（F1）配方甚至在20°C下也能维持数月的可接受稳定性。这为突破mRNA-LNP疫苗和药物对超低温冷链的依赖，实现其在全球范围内、特别是在资源有限地区的公平可及，提供了重要的工艺基础和配方策略。未来研究可进一步结合更深入的表征手段（如透射电镜、差示扫描量热法等），以更全面地揭示稳定化机制，并探索更高效的室温稳定配方。