白色花苜蓿（Medicago sativa L.）是青藏高原盐碱环境中稳定存在的一种特殊的紫花苜蓿表型。传统上，白花常被认为是花青素合成的简单缺陷，属于中性或略微不利的形态标记。然而，其在高海拔寒冷与盐碱混合胁迫环境中的稳定存在，引发了科学家的思考：白花性状是否与系统性的胁迫适应存在关联？本研究通过系统地比较白色花苜蓿与典型的紫色花苜蓿在表型、生理、转录组和代谢组层面的差异，旨在阐明白花性状背后的适应性机制，并为培育抗逆性更强的苜蓿新品种提供理论支持。
1. 引言
盐碱胁迫是全球作物生产力的主要限制因子之一。紫花苜蓿作为最重要的优质豆科牧草，其栽培同样受到盐碱胁迫的严重制约。因此，发掘其抗逆种质资源并解析其适应机制具有重要的战略意义。在驯化过程中，苜蓿主要发育出紫色花冠，但在青藏高原的盐碱生境中，却发现了稳定的白色花个体。越来越多的证据表明，白色花个体可能在特定胁迫环境中具有适应性优势。植物对胁迫的适应涉及多层次的代谢和调控响应。其中，苯丙烷途径既能产生决定花色的花青素，也能合成具有抗氧化和防御功能的类黄酮和单宁。花青素与许多抗逆类黄酮共享上游生物合成途径。因此，色素合成与防御代谢物之间的代谢通量权衡，可能是连接花色与抗逆性的关键环节。基于此，本研究假设白花性状并非孤立的突变，而是一个涉及苯丙烷代谢重编程和激素信号协调的适应性综合征。
2. 材料与方法
2.1. 实验地概况与材料来源
研究地点位于青海省海东市平安区巴藏沟乡，属于温带大陆性气候，年总日照时数2864.4 h，年平均气温7.6 °C，年均降水量310.1 mm。土壤分析表明，其pH为8.19，电导率（EC）为0.48 ms/cm（1:5浸提液），按饱和泥浆标准换算后属轻度盐碱化土壤。供试材料包括“青海地方”紫花苜蓿，以及于2023年首次在该群体中观察到的约占群体10%的白色花个体。通过自交留种，其子代在2024年和2025年均表现出稳定的白花表型，证实了该性状的遗传稳定性。采样时间为2025年7月25日15:00，采集初花期、长势一致的紫花和白色花苜蓿第三片完全展开叶，液氮速冻后保存于-80°C用于后续分析。
2.2. 叶片生理生化指标测定
研究人员测量了花器官形态、光合色素、植物激素、抗氧化酶活性、渗透调节物质（脯氨酸Pro）、氧化损伤指标（丙二醛MDA）、可溶性糖、总黄酮和缩合单宁等。所有数据均以三个生物学重复的平均值±标准差表示，采用独立样本t检验进行显著性分析。
2.3. RNA提取、建库与转录组测序
利用Illumina NovaSeq 6000平台对叶片进行双末端150 bp测序。通过差异表达分析，筛选标准为错误发现率（FDR）≤ 0.05且绝对log2倍数变化（|log2FC|）>1。对差异表达基因（DEGs）进行了KEGG通路富集分析。
2.4. 代谢物提取与LC-MS/MS分析
采用LC-MS/MS对叶片进行广靶代谢组学分析。利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）评估组间差异，筛选差异代谢物（DMs）的标准为变量重要性投影（VIP）≥ 1且t检验p < 0.05。同样进行了KEGG通路富集分析。
2.5. 统计分析
使用SPSS软件进行统计分析，采用GraphPad Prism作图。通过相关性网络分析，探索代谢物与基因表达之间的关联，利用Cytoscape软件对相关性网络（|r| > 0.8, p < 0.05）进行可视化。
3. 结果
3.1. 表型变异
PF表现为深紫色，而WF则完全缺乏花青素，呈白色。定量分析表明，WF的花长（3.04 cm）较PF（3.75 cm）显著减少了18.9%。这表明白花相关的遗传突变可能对植物发育具有多效性影响。
3.2. 生理生化参数差异
WF表现出明显的生长-防御权衡。在生长方面，与PF相比，WF的叶绿素a、叶绿素b和总类胡萝卜素含量分别显著下降了46.0%、14.9%和13.6%；可溶性糖（SS）含量显著增加74.0%；赤霉素（GA）含量显著降低，而茉莉酸（JA）含量显著增加36.3%。在防御方面，脯氨酸（Pro）含量增加51.5%，过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性分别增加了188.2%、12.3%和26.6%；氧化损伤指标丙二醛（MDA）含量降低了33.4%。总黄酮（TF）和缩合单宁（CT）含量分别增加了17.7%和18.2%，表明花青素合成的阻断并未减少总类黄酮流量，反而可能将碳通量转向了其他防御性次生代谢物的合成。
3.3. 转录组分析与差异表达基因
PCA分析显示，PF与WF样本沿主成分1（PC1）轴完全分离，占总变异的99.4%，表明花色变异引发了系统性基因表达重编程。共鉴定出21,456个显著DEGs，其中在WF中上调10,515个，下调10,941个。KEGG通路富集分析显示，DEGs显著富集于“氨基酸生物合成”、“代谢途径”、“光合作用”和“碳代谢”等核心代谢通路，这与生理表型数据高度吻合。此外，“次生代谢物生物合成”通路也显著富集，为解析花青素缺陷的代谢补偿机制提供了候选遗传资源。
3.4. 代谢组学分析与差异代谢物
代谢物组成分析共鉴定出3130种代谢物，主要包括脂质、酮醛酯、萜类和氨基酸等。OPLS-DA模型显示PF与WF样本完全分离，模型预测能力强（R2Y = 0.99, Q2= 0.98）。KEGG通路富集分析显示，差异代谢物显著富集于“氨酰-tRNA生物合成”、“代谢途径”、“植物次生代谢物生物合成”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”等通路。特别是苯丙氨酸代谢（苯丙烷途径）的显著富集，为阐明花青素缺陷的代谢补偿提供了直接证据。
3.5. 转录组与代谢组联合分析
联合分析明确了苯丙烷生物合成和植物激素信号转导这两个核心通路。在苯丙烷通路中，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸在WF叶片中积累，同时相关基因表达模式复杂。例如，苯丙氨酸与MYB型转录因子同源基因MsSINAL10呈显著负相关，这可能解除了对苯丙氨酸解氨酶（PAL）途径的抑制，促进苯丙氨酸向肉桂酸转化，为类黄酮和木质素合成提供前体。酪氨酸则与一系列涉及RNA修饰、钙信号、核糖体生物发生、叶绿体发育等广泛生物学过程的基因存在显著关联，暗示其在WF叶片中可能从细胞壁合成和激素代谢转向防御性生物碱和抗氧化化合物的生产。
在植物激素信号转导通路中，水杨酸（SA）通路表现出“受体激活但下游抑制”的异常调控模式，而JA信号通路在生理和分子层面均表现出系统性激活。这种JA主导、SA受抑制的激素平衡格局，可能导致WF倾向于采取JA介导的诱导性防御策略。
4. 讨论
4.1. 花色变异的代谢重编程
白色花苜蓿在盐碱高原环境中的稳定存在揭示了一种协调的代谢表型。本研究的多组学数据表明，白花性状与苯丙烷网络的系统性重塑相关。观察到的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸积累，表明发生了代谢通量的重定向而非被动终产物的堆积。这种模式与其他植物在初级途径受扰时的代谢再平衡一致。但需注意，观察到的代谢物和基因表达变化仅为相关性，提出的代谢通量重定向是从前体积累和下游产物增加推断而来，其因果关系需进一步验证。
4.2. 抗氧化防御系统的响应
白色花苜蓿表现出增强的抗氧化能力，SOD、POD、CAT活性显著提高，MDA含量降低，表明氧化损伤减轻。同时增加的脯氨酸（Pro）可能在氧化还原稳态中发挥作用。值得注意的是，WF中叶绿素含量的降低，既可以解释为光合功能受损，也可能是一种限制高光胁迫下活性氧产生的适应策略，目前的数据尚无法区分这两种可能性。
4.3. 激素信号网络的重构
WF植株中赤霉素（GA）含量降低和茉莉酸（JA）含量升高，符合生长-防御权衡的理论框架。水杨酸（SA）信号通路显示出复杂的表达模式，可能存在通路瓶颈或将资源转向JA介导的非生物胁迫响应。但需注意，这些分子机制仍是推测性的，需要针对性的分子分析来提供直接证据。
4.4. 其他解释与研究局限
一种替代性解释是，白花性状可能源于中性突变，并无直接的适应意义，所观察到的生理变化可能是同一突变的多效性后果或连锁不平衡的结果。尽管白花性状在三代中的稳定遗传和一致的多组学模式支持适应性综合征的解释，但尚不能完全排除中性或多效性解释。本研究的其他局限性包括：依赖相关性数据、仅分析了叶片、单点设计限制了普适性、单时间点采样无法捕捉胁迫动态、未评估生物量等农艺性状。
4.5. 对苜蓿育种的意义
尽管如此，本研究为苜蓿育种提供了宝贵资源。花大小减少、叶绿素a降低、CAT活性激增等一系列表型共同定义了与白花性状相关的综合征。所鉴定的候选基因，特别是那些参与苯丙烷通路调控和激素信号转导的基因，可作为选育兼具白花观赏性和增强抗逆性育种材料的分子标记。所观察到的代谢重编程模型表明，精确调控苯丙烷途径的分支点，可能有望克服观赏品质与抗逆性之间的传统权衡，有助于开发适合边际土地栽培的苜蓿新品种。
5. 结论
白色花苜蓿在盐碱高原生境中的稳定存在，凸显了其通过系统调控发展出的适应性策略。该表型通过花形态收敛（花长减少18.9%）和光合系统减弱（叶绿素a降低46.0%），将资源重新分配至防御系统。茉莉酸（JA）信号通路的激活与赤霉素（GA）途径的抑制协同作用，将代谢通量导向脯氨酸（增加51.5%）积累，并协同增强抗氧化酶系统（过氧化氢酶CAT活性升高188.2%），最终使氧化损伤减少33.4%。这些变化的核心机制在于苯丙烷代谢网络的重构。花青素合成的中断并未减少次生代谢通量，而是将L-苯丙氨酸和L-酪氨酸等前体物质转向了总黄酮和缩合单宁（分别增加17.7%和18.2%）的生物合成，从而在代谢防御机制与花色缺失之间建立了耦合效应。生理代谢与分子调控的整合表明，白花性状是植物在胁迫环境下通过多层次协同适应所形成的综合性状，这为野生种质资源的利用提供了新的理论框架和育种途径。
