1. 引言
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (Di-2-Ethylhexyl Phthalate, DEHP) 是全球使用最广泛的增塑剂之一。它被添加到聚氯乙烯 (Polyvinyl Chloride, PVC) 材料中以增强其柔韧性和耐用性。由于DEHP与塑料通过非共价键结合，它很容易浸出到周围环境中，普遍存在于食品包装、医疗器械和消费品中，导致人类通过摄入、吸入、皮肤接触以及医疗过程中的肠外途径广泛暴露[1] 。暴露后，DEHP迅速水解为其初级代谢物，即单-2-乙基己基邻苯二甲酸酯 (Mono-2-Ethylhexyl Phthalate, MEHP)，这是人体组织中主要的生物活性和毒理学相关物质。MEHP在人体尿液和血液中持续被检出，并干扰内分泌、代谢和细胞稳态[2] 。因此，DEHP和MEHP被归类为具有重大公共卫生意义的内分泌干扰化学物质，越来越多的证据将其暴露与生殖异常、代谢功能障碍和致癌作用联系起来[3] 。
不断扩大的实验证据表明，MEHP在多个器官系统中具有生物学上合理的促癌作用。最近的几项研究已将MEHP与前列腺癌的发生和进展联系起来。体外和体内前列腺癌模型已证明，MEHP暴露可增强细胞增殖、迁移和侵袭，而长期暴露则会增加致瘤性，并重编程恶性进展的核心信号通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (Phosphatidylinositol-3-Kinase/AKT, PI3K/AKT) 和丝裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK) 通路以及代谢调控网络[4] 。从机制上讲，MEHP作为一种内分泌干扰配体，能够调节核受体活性，特别是过氧化物酶体增殖物激活受体 (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPAR) 家族成员，并改变雄激素和类固醇激素信号传导。同时，MEHP会诱导氧化应激、线粒体功能障碍和炎症小体激活，这些共同促进慢性炎症、细胞存活和基因组不稳定性[5,6] 。表观遗传失调是MEHP作用的另一个日益被认识的机制，它与DNA甲基化景观的改变以及与肿瘤发生和进展相关的下游基因表达程序的变化有关[7,8] 。尽管直接联系邻苯二甲酸酯代谢物与前列腺癌的流行病学数据仍然有限，但基于人群的研究已报告邻苯二甲酸酯暴露与多种恶性肿瘤风险以及增殖潜力的中间生物标志物（如白细胞端粒长度）之间的关联，支持了其在人类中的生物学合理性[9,10] 。重要的是，参与DEHP/MEHP代谢的基因（包括羧酸酯酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶和磺基转移酶）以及MEHP反应信号通路中的个体间遗传变异可能影响内部暴露水平、受体敏感性和下游转录反应。虽然专门研究前列腺癌中MEHP-基因相互作用的研究很少，但之前的研究表明，PPAR基因和外源物代谢酶中的多态性可以改变邻苯二甲酸酯暴露与癌症或激素相关结局之间的关联，这支持了一个可靠的基因-环境相互作用框架[11,12,13] 。
理解MEHP暴露、宿主遗传易感性和前列腺癌进展之间的相互作用对于接受雄激素剥夺疗法 (Androgen Deprivation Therapy, ADT) 的患者尤其相关，因为激素紊乱可能与内分泌干扰环境暴露相互作用。识别MEHP调控通路中赋予侵袭性疾病或不良结局风险的生殖系变异，可能揭示环境致癌物-宿主基因组相互作用的新型生物标志物和机制见解。因此，本研究在一个包含630名接受ADT治疗患者的队列中，评估了MEHP调控基因的变异与前列腺癌进展之间的关联。
2. 患者与方法
2.1. 人前列腺上皮细胞中MEHP暴露的转录组学分析
为了表征MEHP诱导的转录反应，从基因表达综合数据库获取了公开可用的基因表达数据集，包括GSE67396和GSE67397。这些数据集是使用永生化非致瘤性人前列腺上皮细胞系PNT1A生成的。细胞分别用载体对照、低浓度 (0.01 µM)、中浓度 (1 µM) 或高浓度 (100 µM) 的MEHP处理48小时。转录组分析使用安捷伦SurePrint G3人类基因表达8x60K微阵列平台进行。GSE67396数据集包含4个对照样本、3个低剂量样本和4个中剂量样本，而GSE67397包含4个对照样本和4个高剂量样本。处理后的表达矩阵被下载并使用R软件分析。使用Limma包中的Voom函数进行数据归一化和精度加权。使用Limma进行差异基因表达分析，比较MEHP处理样本与载体对照。为了在这种探索性毒理基因组学背景下为下游通路分析保留生物学信号，基因首先在名义p值小于0.05的水平上进行过滤，随后要求基因表达变化方向在多个MEHP浓度下保持一致。使用排名的对数倍数变化值进行基因集富集分析 (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)，以识别显著改变的生物学过程和通路[14] 。使用clusterProfiler包对基因本体论 (Gene Ontology, GO) 类别和京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 通路进行富集分析。
2.2. 研究人群和临床数据收集
临床队列源自中国台湾进行的一项基于医院的前列腺癌研究[15] 。从三家医疗中心招募了经组织学确诊为前列腺腺癌的患者。符合条件的患者接受ADT治疗，包括双侧睾丸切除术，或促黄体生成素释放激素激动剂联合或不联合抗雄激素治疗。排除临床病理学数据或随访信息不完整的患者。排除后，最终分析纳入了630名患者。本研究获得了高雄医学大学附设医院机构审查委员会的批准，所有参与者均提供了书面知情同意书。研究根据赫尔辛基宣言和良好临床实践指南进行。从医疗记录中提取基线人口统计学和临床病理学数据。患者每月定期随访，每3个月进行一次前列腺特异性抗原 (Prostate-Specific Antigen, PSA) 测量。疾病进展定义为至少连续两次PSA水平超过PSA最低点并间隔超过1周，或因PSA水平升高而开始二次内分泌治疗[16] 。进展时间从开始ADT计算到进展日期。总生存期 (Overall Survival, OS) 定义为从开始ADT到任何原因死亡的时间，前列腺癌特异性生存期 (Cancer-Specific Survival, CSS) 定义为从开始ADT到因前列腺癌死亡的时间。死亡原因通过参考台湾卫生福利部维护的国家死亡登记簿确定。在165.8个月的中位随访期内，518名患者观察到疾病进展。记录了414例死亡，其中314例归因于癌症[17] 。关键的临床变量，包括年龄、开始ADT时的PSA水平、临床分期、格里森评分、PSA最低点和达到PSA最低点的时间，均与无进展生存期 (Progression-Free Survival, PFS)、OS和CSS显著相关。
2.3. 单核苷酸多态性 (Single-Nucleotide Polymorphism, SNP) 选择和基因分型
SNPs选自转录组分析中确定为受MEHP共同调控的14个基因。使用Haploview软件基于千人基因组计划中汉族人群的单倍型连锁不平衡模式识别标签SNPs[18] 。选择标准包括次要等位基因频率 (Minor Allele Frequency, MAF) 大于0.03，连锁不平衡 (Linkage Disequilibrium, LD) 阈值r2 大于0.8。使用QIAamp DNA Blood Kit试剂盒从外周血白细胞中提取基因组DNA。基因分型在台湾国家基因组医学中心使用Axiom基因分型芯片进行[17] 。应用标准质量控制程序，排除低检出率的样本和检出率小于90%、MAF小于0.03或偏离哈迪-温伯格平衡的SNPs。经过质量控制过滤后，保留了158个SNPs用于后续分析。盲法重复样本的基因分型一致性为100%。
2.4. ANO4表达和功能的生物信息学分析
为了评估ANO4在前列腺癌中的临床相关性，从多个公共资源获取了基因表达数据。使用随机效应模型通过Review Manager软件进行荟萃分析，评估ANO4表达水平在前列腺癌组织和正常前列腺组织之间的差异。为了获得机制性见解，根据ANO4表达中位数将癌症基因组图谱前列腺腺癌 (The Cancer Genome Atlas Prostate Adenocarcinoma, TCGA-PRAD) 样本分为高表达组和低表达组。使用Limma包进行差异基因表达分析。对排序后的基因列表进行GSEA分析，针对来自分子特征数据库的GO和KEGG基因集。使用1000次排列确定富集显著性，错误发现率小于0.05被视为具有统计学意义。使用Enrichplot包可视化关键的富集通路。
2.5. 统计分析
使用R和SPSS软件进行统计分析。使用Cox比例风险回归模型评估遗传变异、临床病理学变量和临床结局之间的关联。计算风险比 (Hazard Ratios, HRs) 和95%置信区间 (Confidence Intervals, CIs)。对于这项探索性遗传关联研究，初步筛选使用名义双侧p值小于0.05的标准。为了考虑多重检验，计算了错误发现率q值；然后根据各种临床终点证据的汇聚性对候选基因进行优先排序。
3. 结果
为了表征MEHP在前列腺细胞中的转录效应，使人永生化的正常前列腺上皮 (PNT1A) 细胞暴露于载体对照、低 (0.01 µM)、中 (1 µM) 或高 (100 µM) 浓度的MEHP。差异表达分析在所有暴露水平下均鉴定出大量MEHP反应基因。具体而言，在低、中、高剂量MEHP处理后，分别检测到1141、3417和677个差异表达基因 (Differentially Expressed Genes, DEGs)。由于严格的错误发现率控制产生的差异表达基因不足以进行稳健的通路分析，我们采用分层方法来优先考虑最可靠的目标。比较分析揭示了在所有三种MEHP浓度下持续发生改变的19个差异表达基因。在这些共享基因中，14个表现出一致的表达变化方向，包括3个上调和11个下调基因。此外，其中7个基因显示出随着MEHP浓度增加而呈现清晰的剂量依赖性表达模式，这表明对MEHP暴露的转录反应是稳健且具有生物学相关性的。
为了研究MEHP诱导的转录变化的生物学意义，使用排序后的差异表达谱进行了GO、KEGG和GSEA分析。GSEA显示，在所有MEHP浓度下，与细胞-基质黏附、轴突发育和神经元分化涉及的细胞形态发生相关的生物学过程均显著负富集。与此一致，细胞组分分析显示黏着斑、细胞-基质连接、细胞-细胞连接和基底膜呈负富集。分子功能分析进一步突出了细胞黏附分子的结合。KEGG通路分析证实了这些发现，确定黏着斑是MEHP处理后显著下调的通路，强调了MEHP在损害前列腺上皮细胞黏附和结构完整性中的潜在作用。
为了探索MEHP反应基因在前列腺癌进展中的临床相关性，我们在一组接受ADT治疗的前列腺癌患者队列中评估了14个常见MEHP调控基因中的158个SNPs。我们初步的探索性分析在名义p小于0.05的水平上识别出不同的预后遗传决定因素。具体而言，SFRP1、ADAMTS8和ANO4中的7个SNPs与PFS显著相关，而MEGF6和ANO4中的7个SNPs与OS显著相关。此外，PDE5A、SFRP1、ANO4、ASGR2和ZNF433中的9个SNPs与CSS显著相关。其中，ANO4中的rs17485225与OS和CSS均显著相关。与主要G等位基因携带者相比，rs17485225次要A等位基因携带者表现出全因死亡风险和癌症特异性死亡风险降低。虽然单个SNPs（如rs17485225）计算出的错误发现率较高，但ANO4是唯一一个在三个临床终点上均有关联SNPs的基因，这提供了必要的汇聚证据，使其成为首要候选基因。
鉴于在ANO4中观察到的遗传关联的一致性，我们检查了其在前列腺癌中的表达和临床相关性。对34个公共数据集的荟萃分析表明，ANO4表达水平在前列腺癌组织中显著低于正常前列腺组织。尽管存在显著的统计异质性，表明效应的确切程度在不同临床队列中自然存在差异，但总体的方向性趋势一致地显示ANO4在癌症中表达降低。此外，对10项独立研究的荟萃生存分析显示，较高的ANO4表达水平与前列腺癌患者改善的预后显著相关，尽管存在跨队列差异，但也显示出类似的一致方向性关联。这些发现支持ANO4在前列腺癌进展中潜在的肿瘤抑制作用，而MEHP暴露会削弱这种作用。
为了探究ANO4保护作用的机制，我们比较了TCGA-PRAD数据集中ANO4高表达组和低表达组的转录组。GSEA显示，ANO4低表达组（其生存结局较差）在细胞周期相关过程中显著富集，包括染色体分离和姐妹染色单体分离。相反，ANO4高表达组在结构完整性术语中呈正富集，包括收缩性肌纤维、肌节组织和细胞外基质成分，而在核糖体亚基成分中呈负富集。与我们MEHP处理数据一致，对ANO4相关基因的KEGG分析进一步突出了黏着斑和细胞骨架相关通路，同时显示核糖体通路的下调。这些发现强化了MEHP介导的ANO4抑制会损害黏着斑完整性并可能驱动疾病进展的假说。
4. 讨论
我们的研究整合了增塑剂代谢物MEHP对人前列腺上皮细胞影响的转录组学和临床分析，揭示了可能促进前列腺癌进展的潜在基因-环境相互作用。我们证明，MEHP暴露诱导了显著的转录重编程，主要表现为参与黏着斑和细胞-基质相互作用的基因下调。重要的是，MEHP反应基因（特别是ANO4）内的遗传变异与接受ADT治疗患者的生存结局显著相关。ANO4表达降低（重现了MEHP的抑制作用）与不良预后相关。这些观察结果提出了一个基因-环境模型，其中ANO4可能作为连接环境暴露与前列腺癌细胞周期控制失调和黏着斑完整性受损的潜在介质，尽管我们目前的数据无法确定明确的因果关系。
越来越多的证据表明，MEHP通过激活促迁移和侵袭信号来促进癌症进展。这与我们观察到MEHP抑制细胞-基质黏附基因并破坏结构完整性是一致的。此外，MEHP激活非经典致癌通路，包括G蛋白偶联雌激素受体介导的AKT信号、转化生长因子-β/SMAD信号和核因子-κB信号，这些通路共同增强了多种癌症的存活、迁移和侵袭。与以往强调信号激活的研究不同，我们的数据独特地确定了黏着斑抑制是MEHP可能促进恶性进展的核心机制。黏着斑将上皮细胞锚定在细胞外基质上，并传递抑制运动和增殖的线索。破坏这些复合物会削弱黏附强度，促进细胞骨架重塑，并增强迁移和转移潜力。此外，这种不稳定性促进了对失巢凋亡的抵抗，使播散的肿瘤细胞得以存活。总体而言，观察到的MEHP相关黏着斑抑制可能与多种致癌信号协同作用，促进前列腺癌进展。
与MEHP的促肿瘤作用一致，我们的临床和生物信息学分析将ANO4确定为一种保护性基因；其下调预示着不良的前列腺癌结局。尽管ANO4最初被描述为TMEM16家族成员，具有有限的钙离子激活氯离子通道活性，在特定细胞环境中对增殖有适度影响，但ANO4在调节与细胞黏附和运动性相关的质膜动力学中显示出更广泛的作用。值得注意的是，ANO4具有磷脂爬行酶活性，促进磷脂酰丝氨酸外化，并增强ADAM家族金属蛋白酶（包括ADAM10和ADAM17）的脱落酶活性。这调节了黏附受体和生长因子前体的切割，促进受控的黏附重塑，而不是不受控制的侵袭。在非转移性肾透明细胞癌中，ANO4表达降低与晚期分期和不良生存相关，而上皮黏附和连接完整性通路在ANO4高表达的肿瘤中富集。此外，特定的ANO4生殖系变异独立预测了根治性前列腺切除术后的生化复发，这表明宿主遗传因素可能影响对MEHP诱导的ANO4抑制和后续肿瘤进展的易感性。
为了探究ANO4变异的功能相关性，我们通过HaploReg数据库进行了计算机功能注释。内含子SNP rs17485225很可能通过其连锁不平衡区域影响调控元件，而不是直接改变蛋白质结构。我们的分析显示，rs17485225与位于富含活性增强子标记和DNase超敏位点区域内的邻近变异处于强连锁不平衡状态。这些连锁的变异预计会改变对细胞周期调控和肿瘤发生至关重要的转录因子的结合基序，并且显示出与转录共激活因子如P300的既定结合。尽管查询的数据库在可用靶组织中缺乏直接将该单倍型与ANO4表达联系起来的重要表达数量性状位点，但强增强子染色质状态和转录因子基序破坏的汇聚强烈暗示了基因调控作用。因此，我们假设这些非编码变异可能在环境刺激或激素变化下调节ANO4的转录活性，尽管需要通过报告基因检测或前列腺癌模型的基因组编辑进行直接的实验验证。
我们的通路分析进一步描述了ANO4下调的下游后果，揭示了一个以细胞周期和核糖体生物合成通路上调以及黏着斑信号抑制为特征的转录程序。激活细胞周期调节因子驱动不受控制的增殖，而增加的核糖体生物合成支持快速分裂肿瘤细胞对蛋白质合成需求的增加。相反，完整的黏着斑信号通过维持上皮完整性和接触抑制来抑制转移。越来越多的证据支持一个双相模型，即黏着斑机制的过度上调和稳定化会抑制而非促进癌症进展。虽然动态周转是有效迁移所必需的，但黏着斑复合物的过度强化会机械地将肿瘤细胞锚定在细胞外基质上，从而损害运动性、有丝分裂变圆和侵袭。上调包括DLC1、TNS2和整合素α2β1在内的黏附稳定因子，使细胞转向具有低周转率的大型超成熟黏着斑的强黏附状态。因此，ANO4的缺失，无论是内在的还是通过MEHP暴露，都可能破坏这一保护轴，可能将增强的增殖与增加的转移潜力汇聚在一起。这种双重效应提供了一个假定的机制框架，将环境毒物暴露与侵袭性前列腺癌表型联系起来，这需要在具有匹配暴露和基因组数据的队列中进行验证。
本研究的优势包括将体外转录组学分析与临床遗传关联分析整合到一个特征明确的接受ADT治疗的患者队列中。这种多维方法支持了MEHP暴露、宿主遗传学和临床结局之间生物学上合理的联系。然而，一些局限性值得考虑。首先，尽管使用永生化的正常前列腺上皮PNT1A细胞模拟了早期的场癌化，但这种非致瘤模型不能完全复现已确立的前列腺癌生物学特征。特别是，它缺乏肿瘤内异质性、微环境相互作用以及与我们的临床队列相关的雄激素剥夺状态下的独特选择压力。尽管我们通过在TCGA-PRAD数据集中验证ANO4部分弥合了这一差距，但未来的机制研究必须在雄激素剥夺条件下使用肿瘤来源的模型来验证MEHP-ANO4轴。其次，已鉴定的ANO4 SNP对表达和蛋白质活性的功能后果需要实验验证。第三，为了避免在这项探索性风险基因搜寻研究中过早地消除重要的生物学信号，我们的遗传筛选使用了名义p值，而没有进行严格的错误发现率校正。我们通过根据三个临床终点的汇聚证据优先考虑ANO4来减轻假阳性；尽管如此，这些探索性信号需要独立的验证。最后，我们的暴露推断完全依赖于体外转录组扰动结合独立的临床遗传关联。由于我们的回顾性设计缺乏患者水平的邻苯二甲酸酯测量数据，暴露和基因型从未在同一受试者中关联。因此，无法建立MEHP暴露与临床结局之间的因果关系。这强调了需要进行前瞻性研究，结合配对邻苯二甲酸酯代谢物谱分析和基因组数据，以验证这些提出的基因-环境关联。
5. 结论
总之，我们的研究结果提示MEHP是前列腺上皮黏附程序的潜在调节因子，确定了黏着斑抑制和ANO4表达降低是与侵袭性前列腺癌进展相关的因素。这项工作强调了基因-环境相互作用在癌症生物学中的重要性，将黏着斑网络定位为潜在的生物标志物或治疗靶点。未来的MEHP暴露体内研究和ANO4介导的黏附信号传导的功能解析对于验证这些机制和评估其转化相关性至关重要。
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