1. 引言
抗菌素耐药性（AMR）是重大的全球公共卫生威胁，动物生产系统中的抗生素使用是其驱动因素之一。世界卫生组织（WHO）已将畜牧业视为“同一健康”（One Health）网络中缓解AMR的关键节点。尽管集约化牲畜养殖历来是研究焦点，但包括绵羊和山羊养殖在内的粗放系统同样会治疗性和预防性使用抗生素，从而维持了筛选携带抗生素抗性基因（ARGs）细菌的选择压力。在葡萄牙，小反刍动物养殖是农业景观的重要组成部分，尤其在边缘地区。2022年数据显示，葡萄牙四环素类和青霉素类是畜牧业中使用的主要抗生素类别。然而，针对葡萄牙粗放式小反刍动物系统中ARG多样性的全面宏基因组数据仍然缺乏。现有研究多限于靶向检测方法。本研究旨在通过鸟枪法宏基因组测序，首次全面、无偏向性地描绘葡萄牙小反刍动物农场环境中的抗性基因组和微生物组特征。
2. 结果
2.1. 不同农场类型的微生物群落分类组成
对所有样本进行测序分析后发现，不同农场类型（绵羊、山羊、混合农场）的微生物群落在门水平上组成相似，均以假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）、芽孢杆菌门（Bacillota）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主导。这些优势门类共同构成了农场环境中的核心微生物组，组间无显著统计学差异。
2.2. 不同农场类型的抗生素抗性基因分布与丰度
通过对环境样本的宏基因组测序，共检测到覆盖15个抗生素类别的706个独特ARGs。就基因多样性而言，β-内酰胺类（n = 163）、氨基糖苷类（n = 143）和四环素类（n = 113）最为丰富。就基因丰度而言，四环素类（44.65%）和氨基糖苷类（24.07%）抗性基因在所有样本中占主导地位，其次是林可酰胺类（9.14%）和大环内酯类（5.27%）。这四类ARGs合计占所有样本中观察到的总ARG相对丰度的70%以上。
比较不同农场类型的抗性基因组组成发现，总体而言三类农场的ARG类别组成相似。但具体分析显示，截短侧耳素（pleuromutilin）抗性基因在山羊农场中显著更丰富，而磷霉素（fosfomycin）抗性基因在混合物种农场中富集。不过，整体抗性基因组组成在农场类型间无显著差异。
2.3. 微生物属与抗生素抗性基因的相关性网络
相关性网络分析揭示了细菌属与ARGs之间基于丰度的关联。在该网络中，大多数ARGs，包括那些与碳青霉烯类、头孢菌素类和糖肽类等关键重要抗生素（CIA）和最高优先级关键重要抗菌药物（HPCIA）相关的基因，主要与环境细菌和共生细菌属相关，而非与更常见的致病菌属相关。例如，环境细菌Fibrisoma与多种β-内酰胺酶基因（如blaOXA-277 、blaADC-74 ）及氨基糖苷类抗性基因aph(2″)-IIIa呈正相关。糖肽类抗性基因vanR-SC是网络中最大的枢纽之一，与多个环境细菌属相关联。相反，与包含病原体或机会致病菌的属相关的ARGs则形成了更小、更孤立的网络簇。例如，机会致病菌形成了一个以四环素抗性基因（如tet(k)、tet(Z)）为中心的小簇。总体而言，该网络表明在此系统中，ARG的发生主要与共生和环境类群共变，而涉及人类病原体或机会致病菌属的关联则不那么突出。
3. 讨论
本研究揭示了小反刍动物农场环境中存在一个保守的核心微生物组和抗性基因组。四环素类、氨基糖苷类和大环内酯类抗性基因的普遍流行，与全球其他农业和牲畜相关微生物组的研究结果一致。虽然这种模式可能与兽用抗菌药的使用有关，但由于缺乏农场详细的抗生素消费数据，无法建立直接联系。值得注意的是，β-内酰胺类ARGs显示出最高的多样性，但相对丰度较低，这可能归因于该类基因天然的高多样性以及β-内酰胺类抗生素在环境中化学性质不稳定、降解较快。
相关性网络分析的结果具有重要的监测意义。大多数ARGs，包括那些对CIA和HPCIA耐药的基因，主要与环境细菌和共生细菌相关联。这与此前的研究一致，即农业废弃物环境中的ARGs通常与非临床细菌群落相关。然而，必须强调的是，ARG的存在及其与特定属的相关性本身并不能证明基因的携带、转移风险或临床相关性。本研究未进行病原体分离，也未生成基因表达数据。因此，对mph(c)、erm(b)、qnrD1等HPCIA相关基因的检测结果，应置于环境监测框架内解读，而非作为可传播或具有临床可操作性耐药性的直接证据。
与课题组先前使用定量聚合酶链式反应（qPCR）的靶向研究相比，本次宏基因组学方法实现了更高的检测率。然而，先前qPCR检测到的临床重要超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因blaCTX-M 和blaTEM 在本研究的宏基因组数据集中未检测到，这可能反映了方法学差异（如qPCR灵敏度更高但靶向范围窄，宏基因组学覆盖广但可能漏检低丰度靶标）或季节性因素（本研究在秋季采样，而先前研究在春夏季）的影响。
本研究也存在一些局限性。首先，每个农场使用单个复合环境样本（混合了水、垫料、牧草和土壤）的方法，无法将检测到的ARGs归因于特定的环境基质。其次，缺乏详细的抗菌药物使用记录，限制了将ARG流行率与抗生素使用直接联系起来的能力。第三，研究专注于ARG检测，未评估基因表达或功能活性。第四，未量化绝对细菌丰度。最后，也是重要的一个局限是，未评估检测到的ARGs的移动潜力，即未分析这些基因是否与质粒、整合子或转座酶等可移动遗传元件（MGEs）相关联。因此，关于水平基因转移（HGT）潜力和储存库风险的陈述需谨慎解读。
4. 材料与方法
研究于2024年9月至10月从葡萄牙中部的46个农场（31个绵羊场、11个山羊场和4个混合场）采集了环境样本。从每个农场采集一个复合环境样本，包含饮用水、动物垫料、放牧草场和畜舍土壤四种基质。样本经混合后，使用土壤基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。鸟枪法宏基因组文库制备遵循Illumina兼容方案，在NovaSeq X Plus平台上进行测序，每个样本产生约9 Gb原始数据。
生物信息学分析流程包括：使用Fastp进行原始读段质量控制；使用BWA-MEM比对并去除宿主（绵羊和山羊）基因组序列；使用Kraken2和Bracken对去宿主后的读段进行微生物分类学分析；使用ARGprofiler工具将质控后的读段与综合抗生素抗性基因数据库（PanRes数据库）比对，以鉴定和量化ARGs。统计分析包括使用方差分析（ANOVA）比较不同农场类型间ARG类别丰度的差异，并使用置换多元方差分析（PERMANOVA）评估整体抗性基因组组成的差异。使用Spearman等级相关系数评估细菌属与ARGs之间的关联，并构建相关性网络。
5. 结论
本研究首次通过宏基因组学全面表征了葡萄牙绵羊、山羊及混合物种农场环境中的微生物组和抗性基因组。研究发现，不同农场类型共享一个保守的核心微生物组（以假单胞菌门、放线菌门等为主）和一个稳定的核心抗性基因组（以四环素类、氨基糖苷类和大环内酯类抗性基因为主导）。研究结果凸显了小反刍动物农场环境是临床相关ARGs的潜在储存库，其中包含WHO定义的HPCIA（如大环内酯类、氟喹诺酮类）和CIA（如糖肽类、氨基糖苷类）的抗性基因。这支持了将此类环境纳入“同一健康”监测策略的必要性。未来的研究应致力于确定ARG的表达、量化微生物负荷、评估抗生素使用的贡献，并调查这些环境中抗性基因的具体来源和移动性，以更好地为缓解策略提供信息。
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