来自印度手足口病患者的A71基因型A（BrCr类似）人类肠道病毒近乎完整的基因组序列

时间：2026年3月11日

来源：Microbiology Resource Announcements

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本研究完成印度拉贾斯坦邦（2022）和密兹拉姆邦（2024）2株EV-A71近全基因组测序，证实均属A型（BrCr-like），与全球分离株（美国、日本、中国）系统发育关系密切，填补了印度EV-A71完整基因组数据空白。

摘要

我们报告了来自印度拉贾斯坦邦（2022年）和米佐拉姆邦（2024年）的两种人类肠道病毒A71（EV-A71）分离株的近乎完整的基因组（约7.4 kb）。基因分型和系统发育分析表明，这两种分离株均属于基因型A（BrCr型），进一步丰富了与手足口病相关的EV-A71病毒多样性。

公告

肠道病毒A71（EV-A71）属于Enterovirus alphacoxsackie属（Picornaviridae科），是手足口病（HFMD）的主要致病因子，可能导致儿童出现严重的神经系统并发症（1）。尽管印度有手足口病暴发的报告（2 –4），但迄今为止尚未获得近乎完整的EV-A71基因组序列。

在这项研究中，2022年8月17日，在拉贾斯坦邦比卡内尔市的Sardar Patel医学院，从一名临床诊断为手足口病的11岁男童身上采集了疱液拭子样本（NIV2420350）。2024年7月5日，在米佐拉姆邦的Zoram医学院儿科门诊，从一名8个月大的女婴身上采集了鼻咽拭子样本（NIV224291），该女婴出现发热、口腔溃疡以及手部和腹部的疱疹病变，并伴有神经系统症状，这是作为ICMR临时项目2021_9126的一部分进行的病毒监测工作。Zoram医学院的机构人类伦理委员会批准了这项研究（批准函编号：NIV/IEC/March/2023/D1）。初步筛查使用了针对保守的5′ UTR区域的通用肠道病毒引物（5），随后进行了EV-A71特异性VP1基因的扩增（6）。病毒分离是在横纹肌肉瘤（RD）细胞中完成的（7, 8）。具体操作为：将100 µL的临床样本接种到24孔板中的RD细胞上，然后在37°C、5% CO₂条件下培养5–6天。具有细胞病变效应的培养物被收获，并在Vero细胞中进行了两次斑块纯化。病毒RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取。测序文库使用Illumina RNA Library Prep Kit（输入量10–100 ng；目录编号20040537）制备，并通过Illumina Viral Surveillance Panel v2（目录编号20107489）进行富集。测序工作在Illumina MiSeq平台上完成。经过质量筛选的读段（长度35–301 nt）使用rnaSPAdes（v4.0.0）和默认参数进行de novo组装，并使用BWA-MEM（版本0.7.18）和默认参数与EV-A71参考基因组（AB204852.1）进行比对。变异体使用BCFtools（版本1.21）进行鉴定，并生成了共识序列。基因组覆盖度使用SAMtools（v1.21）进行评估，缺失覆盖度的区域在共识序列中被标记出来。最终获得了两个近乎完整的基因组序列，长度分别为7,407 bp（BSM-25-001；NIV2420350）和7,406 bp（S48；NIV224291），平均读段深度分别为6,856×和14,373×，GC含量为47.5%。基因组注释使用VAPiD（v1.6.7）和NCBI RefSeq Viral数据库的默认设置完成（10）。VAPiD根据查询序列与参考基因组的最高BLAST相似性自动选择了参考基因组（RefSeq Viral版本219；访问日期2024年3月）。使用肠道病毒分型工具（默认参数：https://mpf.rivm.nl/mpf/typingtool/enterovirus/）鉴定出这两种分离株均属于EV-A71基因型A（BrCr型）。BLASTn相似性搜索显示，这些分离株与EV-A71菌株AB204852.1（BrCr原型菌株）的核苷酸同一性为99.74–99.80%，且覆盖率为100%（AB204852.1最初来自日本11）。使用IQ-TREE v2（ModelFinder，1,000次超快自助法重复）对完整的VP1区域进行最大似然系统发育分析，结果显示这些分离株与来自美国（U22521.1）、日本（AB204852.1和AB204853.1）和中国的（KF501389.1）的菌株有很强的聚类关系（图1）。

图1