METTL3-14复合物、m6A与疾病
信使RNA（mRNA）内部最丰富的化学修饰是N6-甲基腺苷（m6A）。甲基转移酶样蛋白3和14形成的异源二聚体复合物（METTL3–14）是催化形成m6A的主要人类酶。在该复合物中，METTL3是催化亚基，拥有结合辅底物S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的活性位点；而METTL14则主要参与mRNA结合和稳定复合物结构，其自身的甲基转移酶结构域活性位点功能冗余。m6A修饰失调与多种疾病密切相关，尤其是癌症。例如，METTL3在急性髓系白血病（AML）、淋巴瘤等多种癌症中异常高表达，并通过促进与细胞生长、分化、凋亡相关基因的翻译来推动癌症进展。因此，抑制METTL3–14的甲基转移酶活性成为一种有前景的治疗策略。
METTL3抑制剂研究的挑战与机遇
目前已有多种SAM竞争性的METTL3小分子抑制剂被开发出来，并在AML模型中显示出疗效。此外，蛋白质降解靶向嵌合体（PROTAC）也被用于靶向降解METTL3–14复合物。然而，这些直接靶向METTL3催化口袋的策略均会抑制其甲基转移酶活性，使得研究者无法区分药物效应是源于酶活抑制，还是源于其他机制（如蛋白质-蛋白质相互作用干扰）。因此，寻找不抑制催化活性的新型结合位点具有重要意义。
METTL14隐秘口袋的发现
在本研究之前，所有已解析的METTL3–14复合物结构（无论是apo状态，还是与SAM/其类似物SAH、或大量SAM竞争性抑制剂结合的状态）中，METTL14上的一个潜在口袋都处于关闭状态。本研究团队在优化SAM竞争性METTL3抑制剂的过程中，通过蛋白质晶体学意外发现了两个亚微摩尔级别的抑制剂（化合物1和2），它们不仅能结合METTL3的SAM口袋，其延伸部分还结合在METTL14上一个此前关闭的“隐秘口袋”中，该口袋距离METTL3的催化口袋约46 Å，因此被称为“外部位点”（exosite）。
晶体结构分析表明，配体结合会诱导METTL14第174-183位残基片段发生显著的构象变化，包括一个单圈310螺旋的解折叠，以及异亮氨酸179（Ile179）和亮氨酸182（Leu182）侧链的大位移，从而打开这个隐秘口袋。该口袋在打开时呈现负静电势，且组成残基在序列上多不保守。
专一性外部位点结合剂的设计
基于化合物2与METTL3 SAM口袋及METTL14外部位点的结合模式，研究者进行了理性设计，旨在获得只结合METTL14外部位点而不结合METTL3的化合物。通过将化合物2中与METTL3形成关键氢键的两个氮原子进行替换（一个改为CH，一个改为O），得到了化合物3。
生化实验证实，化合物3在酶活检测中不显示任何抑制活性，说明其不结合METTL3的SAM口袋。然而，晶体结构显示，化合物3能够成功地结合在METTL14的隐秘口袋中，并诱导类似的局部构象变化。热位移实验也证实化合物3能在毫摩尔级浓度下稳定METTL3–14复合物。细胞实验显示，化合物3不会降低细胞内的m6A/A水平，这与它不抑制酶活的特性一致。
外部位点结合剂的应用前景：走向非抑制性异双功能分子
化合物3的发现至关重要，因为它提供了一个不干扰METTL3–14催化活性的结合“锚点”。其分子中的羟基暴露在溶剂中，为连接 linker 提供了理想的位点。因此，它可以作为起点，用于开发异双功能分子，例如蛋白质降解靶向嵌合体（PROTAC）。这类以METTL14为靶点的PROTAC可以实现对METTL3–14复合物的特异性降解，而不影响细胞内其他依赖SAM的甲基转移酶活性，从而有可能揭示不依赖于m6A书写活性的、新的生物学功能和治疗机会。
计算预测的局限性
研究团队还评估了AlphaFold 3（AF3）在预测此隐秘口袋方面的能力。结果表明，无论是预测单个蛋白与配体结合，还是预测复合物与多个配体拷贝结合，AF3均未能成功预测该口袋的打开以及化合物在其中的正确结合模式。这可能是因为训练数据中大量存在的都是该口袋处于关闭状态的结构。同样，对apo状态METTL3–14进行的微秒级分子动力学模拟中，该口袋也未曾自发打开，印证了其开放性需要配体诱导的特性。
结论
本研究通过结构生物学手段，首次在METTL3–14复合物的METTL14亚基上发现了一个配体诱导的隐秘口袋。通过对先导化合物的优化，成功获得了首个特异性结合该外部位点且不抑制甲基转移酶活性的小分子配体（化合物3）。这一发现打破了以往靶向该复合物必须抑制其催化活性的局限，为开发新型的、基于蛋白降解或其他调控模式的异双功能治疗药物奠定了重要的化学与结构基础，推动了表观转录组学靶向治疗领域的发展。
