肝脏是人体的“化工厂”，承担着解毒、代谢等重要功能。然而，许多药物在发挥治疗作用的同时，也可能对肝脏造成损伤，即药物性肝损伤(Drug-Induced Liver Injury, DILI)，这是导致药物研发失败和上市后撤回的主要原因之一。在DILI的各种类型中，胆汁淤积（即胆汁流动受阻）占了相当高的比例，而抗生素是引发此类肝损伤的常见药物之一。准确预测药物的肝损伤潜力，特别是胆汁淤积风险，对于保障用药安全和加速新药研发至关重要。
长期以来，科学家们主要依赖二维(2D)培养的肝细胞和动物实验来评估药物安全性。但2D培养的细胞失去了体内的三维结构和细胞间复杂相互作用，功能往往不完整，难以准确模拟药物在真实肝脏中的代谢和毒性反应。动物实验则存在伦理争议以及物种间代谢差异显著的问题。因此，开发能够更好模拟人体肝脏复杂结构和功能的新型体外模型，成为毒理学和药理学领域的迫切需求。
为了应对这一挑战，一项发表在毒理学权威期刊《Archives of Toxicology》上的研究，提出了一种创新的解决方案。研究人员将目光投向了人源性肝细胞系HepaRG和天然细胞外基质成分——I型胶原。他们设想，如果将HepaRG细胞包裹在仿生I型胶原水凝胶中，构建三维(3D)培养环境，是否能更好地模拟肝脏的微观结构，从而更快、更高效地诱导肝细胞成熟，并提升其对药物毒性，特别是胆汁淤积性损伤的响应能力？基于此，研究团队开展了一系列实验，成功构建并验证了这一3D HepaRG模型，证实其不仅能显著增强肝细胞功能，还能灵敏、特异地检测并深入揭示β-内酰胺抗生素引起的胆汁淤积性肝损伤机制，为临床前药物安全性评估提供了更可靠、更高效的平台。
为了验证这一3D模型的优越性并探究其应用潜力，研究人员运用了多项关键技术。核心模型构建是将HepaRG细胞直接包埋于I型胶原水凝胶中形成3D结构。功能表征层面，通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫荧光技术检测了肝细胞特异性基因和蛋白的表达；通过检测培养基中尿素和白蛋白含量评估合成功能；通过高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定细胞色素P450(CYP)和UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)等代谢酶活性。在毒性评估与机制研究中，采用ATP含量和乳酸脱氢酶(LDH)释放检测细胞活力；利用RNA测序(RNA-seq)进行全局转录组分析；借助高内涵筛选技术同步检测活性氧(ROS)、细胞内钙离子浓度和线粒体超氧化物等多重毒性参数；并通过蛋白质印迹法(Western blot)分析关键信号通路蛋白的磷酸化水平。
研究结果
HepaRG cells cultured in 3D collagen hydrogels with reduced DMSO concentration show increased expression of key hepatic genes compared to 2D culture
与传统的2D培养（需1.7% DMSO分化28天）相比，HepaRG细胞在含有1% DMSO的3D胶原水凝胶中培养14天后，多种关键肝脏基因的表达显著上调。这包括与药物I相代谢（如CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4）和II相代谢（如SULT2A1, UGT1A1, UGT2B7）相关的基因，部分基因表达水平甚至接近正常人肝组织。此外，胆汁酸(BA)合成、尿素循环和抗氧化防御等相关基因的表达也得到增强，而一些在肝细胞成熟过程中本该下调的基因（如KRT19）表达则降低，表明3D培养促进了更佳的肝细胞分化。
HepaRG cells cultured in 3D collagen show improved functionality compared to 2D
功能学检测证实了3D模型的优势。培养14天的3D HepaRG细胞表现出更高的白蛋白和尿素合成能力。同时，多种CYP酶、UGT酶以及谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性均显著高于2D培养的细胞。免疫荧光染色显示细胞表达肝细胞核因子4α(HNF4α)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)、白蛋白、CYP3A4以及胆汁盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)等关键肝细胞标记物和转运蛋白。通过羧基二氯荧光素双乙酸酯(CDFDA)外排实验证实了MRP2转运体的功能活性。这些结果表明，3D胶原水凝胶培养能显著提升HepaRG细胞的肝特异性功能。
Suitability of 3D cultures of HepaRG for hepatotoxicity assessments
研究人员评估了该3D模型在检测胆汁淤积性DILI中的应用。选用三种有胆汁淤积报道的β-内酰胺抗生素——氯唑西林(CLO)、氟氯西林(FLU)、萘夫西林(NAF)，以及阳性对照药波生坦(BOS)和阴性对照药链霉素(STR)进行处理。结果显示，CLO、FLU、NAF和BOS在含有胆汁酸(BA)混合物的培养液中，对细胞活力（ATP含量）的抑制明显增强，计算得到的胆汁淤积指数(CIx)均小于0.8，表明具有胆汁淤积潜力，而STR无此效应。其中，NAF的毒性最强。长期暴露实验（长达14天）也显示，药物毒性随时间延长而增加。
Gene expression in the 3D model after the exposure to cholestatic drugs
转录组分析揭示了药物处理的早期分子变化。CLO和FLU处理通常导致多种胆汁酸代谢、转运以及氧化应激反应相关基因的下调，而内质网(ER)应激标志基因（如ATF4, DDIT3, HSPA5）上调。NAF和BOS则主要引起这些基因的上调。当与BA共同处理时，这些变化趋势更为明显，表明BA环境加剧了药物的转录调控效应。
Exploring the mechanisms of CLO-induced toxicity
针对CLO的深入机制研究表明，RNA-seq分析发现CLO处理（7.5 mM）在有无BA存在下，分别引起了1441和3224个差异表达基因(DEGs)。基因本体(GO)富集分析显示，CLO主要下调了单羧酸代谢、异生物质代谢等通路，而上调了内质网应激反应通路。高内涵筛选证实CLO处理增加了细胞内钙离子浓度、线粒体超氧化物和总ROS水平，表明氧化应激参与其毒性过程。
Signaling pathways modulated by CLO
蛋白质印迹分析发现，CLO处理降低了与细胞生存增殖相关的蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化水平，同时激活了与应激和凋亡相关的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化。这些效应在BA存在下更为显著。使用p38特异性抑制剂阿德泽马皮莫德(SB203580)共处理，可以部分挽救CLO引起的细胞活力下降，证实p38信号通路的激活在CLO诱导的细胞毒性中起关键作用。
研究结论与意义
本研究成功开发并系统表征了一种基于I型胶原水凝胶的3D HepaRG细胞培养模型。该模型仅需1%的DMSO和14天培养，即可使细胞获得优于传统2D培养（1.7% DMSO，28天）的肝细胞基因表达谱和功能成熟度，包括更强的药物代谢酶活性、合成功能及转运体功能。
应用该模型，研究首次在体外再现了CLO、FLU和NAF这三种β-内酰胺抗生素在胆汁酸存在下协同增强的细胞毒性，明确了它们的胆汁淤积潜力，并证明该模型可用于区分胆汁淤积性和非胆汁淤积性肝毒物。深入的机制研究，特别是以CLO为例，揭示其肝毒性涉及氧化应激、内质网应激、以及p38 MAPK信号通路的激活和AKT/ERK信号通路的抑制等多条途径。BA的存在会放大这些药物引起的转录组变化和信号通路扰动，模拟了体内胆汁淤积状态下的复杂微环境。
这项研究的核心意义在于，它提供了一个生理相关性更高、功能更完善、且预测能力更强的体外肝脏模型。与传统的2D模型相比，该3D模型能更敏感、更特异地检测药物的胆汁淤积性肝损伤，并能深入揭示其分子机制。这为在药物研发早期阶段识别和剔除具有肝损伤风险的候选药物提供了有力的工具，有助于减少研发损耗、降低临床风险，并符合“3R”（减少、替代、优化）动物实验的伦理原则。未来，这一模型有望广泛应用于更广泛的药物安全性评价和肝脏毒性机理研究。
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