综述：为聚酯-塑料的解聚作用定制酶

塑料生物降解酶工程研究进展：通过蛋白工程优化PET、PU、PLA、PBAT降解酶的热稳定性、催化效率和表达量，为解决塑料污染提供可持续回收方案，并探讨AI在酶设计中的应用。

陈远涛|何西静|严金元|朱晓敏|王一虎|徐安明|刘家伟|董伟良|姜敏

中国南京工业大学生物技术与制药工程学院，废弃塑料生物催化降解与回收关键实验室，南京 211800

摘要

塑料废物的积累对环境构成了严重且日益增长的威胁，这推动了对可持续回收解决方案的需求。酶促解聚已成为处理和利用塑料废物的一种有前景的绿色替代方法。为了提高其实际应用效果，人们采用了蛋白质工程来优化能够降解塑料的酶。本文总结了在解聚多种塑料（包括聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚氨酯（PU）、聚乳酸（PLA）和聚丁酸丁二醇酯（PBAT）方面酶工程的最新进展，重点关注了热稳定性、催化效率以及重组蛋白表达的改进。同时，也指出了未来改进聚酯塑料降解酶的关键方向。这些发展对于设计高效且具有工业可行性的生物催化剂以应对塑料污染危机至关重要。

引言

自20世纪50年代以来，全球塑料产量持续增长，2023年达到了4.14亿吨[1]。中国是全球最大的塑料生产地区，占总产量的33.3%，其次是北美和欧盟。过去十年间，全球塑料产量增长了约35%，预计到2030年将超过7亿吨，相当于每人80公斤[2]。由于塑料具有稳定的聚合物链和固有的疏水性，它们在自然环境中难以降解，从而导致高昂的回收成本[3]。塑料废物在陆地和海洋生态系统中的积累带来了多重威胁。在土壤中，塑料残留物会改变土壤结构和微生物群落，阻碍作物生长，并可能通过植物吸收进入食物链[4]。在海洋环境中，塑料污染同样严重：据估计，到2025年塑料积累量可能达到2.5亿吨，到2050年，海洋中的塑料总重量可能会超过鱼类的总重量。通过物理、化学和生物过程，塑料逐渐分解成微塑料（<5毫米）。微塑料不仅会对生物体产生毒性作用，如生殖功能障碍和发育异常，而且由于其高比表面积，还能吸附重金属和持久性有机污染物，其浓度可比周围环境高出10^6倍[5]。此外，微塑料还可以作为病原微生物的载体，通过食物网中的营养传递和生物积累促进其传播，最终对人类健康构成风险[5]。

回收被认为是减轻塑料污染的关键策略。根据García和Robertson的研究，回收一吨塑料可以节省1.3×10^8千焦的能量[6]。全球高效的塑料废物回收可以节约相当于约35亿桶原油的能量[3]。然而，当前的全球废物管理仍主要依赖于填埋和焚烧；2019年，大约50%的塑料废物被填埋，20%被焚烧，而回收率仍然很低[7]。如果继续现有的管理方式，预计到2050年将有1.2×10^10吨塑料在填埋场或自然环境中积累[3]。机械回收——包括初级和二级回收——是针对PET和聚乙烯（PE）等特定聚合物最广泛使用的方法[8]，得益于成熟的技术和相对较低的能耗。然而，这种方法存在显著的限制：难以处理混合或受污染的塑料废物，且经过多次回收循环后，分子的重量和机械性能会逐渐下降，阻碍了高价值回收的闭环实现。相比之下，化学回收可以处理更复杂的塑料废物流，但需要高能量输入、苛刻的反应条件（例如高温和高压），并且运营成本较高。特别是在热解和气化过程中，产品需要经过广泛的纯化以去除杂质，这增加了技术挑战和经济负担。

酶促解聚作为一种绿色且高效的方法，已被用于回收废弃的PET[9]（图1）。这种方法依赖于微生物分泌的酶，在温和的反应条件（常温常压）下催化PET聚合物的分解，具有高的底物特异性和可调节的产品组成[10]。与通常需要纯化原料的化学回收不同，酶促解聚具有高的底物特异性，这使得可以从混合的塑料废物流中选择性地回收单体，而无需进行广泛的预分选。此外，微生物或分离出的酶可以将得到的单体转化为高价值的化学品，从而促进塑料的生命周期管理，并为塑料回收提供创新视角[11]。

2005年，从放线菌中鉴定出第一种被确认为真正的PET解聚酶的角质酶TfH。经过三周的培养，TfH使熔融淬火后的消费后PET瓶（结晶度约为10%）的重量损失超过了50%[12]。在随后的16年里，蛋白质工程和工艺优化使T. fusca PET水解酶的降解效率提高了一个数量级以上[13]。宏基因组筛选的进步发现了一种更高效的酶——叶枝堆肥角质酶（LCC），它已成为最有前景的热稳定性PET水解酶之一[14]。然而，大多数这些PET水解酶需要较高的温度才能实现有效的解聚。一个重要的突破是鉴定出来自（一种从受塑料污染的沉积物中分离出的细菌）的IsPETase。这一发现因其独特的酶学特性而受到了广泛关注。2020年，Cbios公司和图卢兹第一大学的研究人员报告了一种通过蛋白质设计改造的LCC变体LCC^ICCG，该变体能够在200克/升的工业负荷下，在10小时内快速降解经过热机械处理以降低结晶度的无定形PET废物[15]。由于其优异的解聚活性和热稳定性，LCC^ICCG已成为PET回收的主要酶工具[16]。然而，要推进塑料生物降解的工业应用，还需要进一步提高解聚酶的催化效率。此外，PET是一种半结晶聚合物，包含无定形和结晶区域。当反应温度接近其玻璃化转变温度（T_g≈65–72℃）时，无定形区域中的聚合物链流动性增加，从而使结构变得更为松散，有利于酶的作用。这表明了酶热稳定性的重要性。此外，传统微生物系统中天然PET水解酶的低表达水平导致生产成本较高，阻碍了大规模应用。为了解决这些挑战，人们正在采用合理的酶工程和设计策略来开发具有改进热稳定性、催化效率和表达能力的新解聚酶，这对于降低成本并实现经济可行的PET废物工业规模生物回收至关重要。

尽管PET水解酶的工程已经达到了相对成熟的阶段，但对其他塑料（如PU和可降解聚合物）的酶修饰仍处于早期阶段。然而，从PET研究中获得的成功策略，包括刚性环的固定和活性位点的重塑，为这些新兴目标提供了宝贵的蓝图。本文系统总结了PET水解酶工程的最新进展，重点关注三个关键目标：热稳定性、催化效率和蛋白质表达。在此基础上，我们探讨了与PU和可降解塑料相关的独特结构障碍，并讨论了旨在克服这些障碍的早期蛋白质工程努力。最终，这项工作旨在为多种塑料废物的酶促转化提供理论和实践指导。

部分摘录

PET解聚酶的工程

针对提高PET水解酶的热稳定性、催化活性和酶表达产量进行工程改造，是推进PET废物工业规模生物处理的核心（图2）。首先，提高热稳定性至关重要，因为PET聚合物在65–72℃以上会转变为玻璃态，此时链段流动性增加，聚合物更容易受到酶的攻击。如果酶本身在这些温度下不稳定，它会迅速

PU解聚酶的工程

PU是一种由脲键作为重复结构单元组成的聚合物。根据所用多元醇的类型，它被分为两大类：基于聚酯的PU和基于聚醚的PU。从结构上看，PU的特点是存在“软段”和“硬段”的独特微相分离（图3）[43]。软段（SS）来源于长链多元醇（聚酯或聚醚），负责材料的柔韧性。相比之下，硬段

可降解塑料解聚酶的工程

可降解塑料的开发被视为解决塑料污染问题的关键途径，并推动塑料行业的绿色转型。与传统塑料不同，可降解塑料可以在特定条件下被微生物分解，并最终重新融入自然，显著减少环境负担。在土壤或海水等自然环境中，降解过程仍然

比较分析和统一工程原理

PET、PU、PLA和PBAT都是含有可水解酯键的聚酯塑料，但它们在酶促解聚方面存在不同的物理化学障碍。理解这些共性和差异对于跨聚合物类型转移工程策略至关重要。

这四种聚合物都容易受到角质酶、脂肪酶和酯酶等水解酶催化的酯键断裂的影响。这种机制上的共性意味着改进催化策略的策略是可行的

研究需求和未来方向

通过整合人工智能和机器学习，塑料降解酶的合理设计即将迎来革命。传统的蛋白质工程依赖于基于晶体结构的定向突变，通常是迭代且劳动密集型的。人工智能驱动的方法可以通过预测结构-功能关系并识别增强关键酶特性的非直观突变来克服这些障碍。在大量蛋白质数据集上训练的机器学习模型

结论

塑料的酶促解聚代表了一条通往循环塑料经济的有前景的道路，但要实现其全部潜力，仍需解决若干科学和技术挑战。本文介绍了可降解塑料解聚酶的进展，并确定了作用于不同类型聚酯塑料的酶的关键修饰目标。然而，仍存在一些挑战，例如在高结晶度底物上的活性有限、产物抑制以及不足

环境影响

随着全球塑料生产和废物积累的加剧，开发用于PET解聚的强健酶对于减少环境负担和推进循环塑料管理至关重要。通过总结提高作用于PET、PU、PLA和PBAT的酶的热稳定性、催化效率和表达能力的策略，本文将分子工程与工业相关条件联系起来。这些进展支持了低能耗回收和减少微塑料

CRediT作者贡献声明

严金元：方法学。徐安明：项目管理。王一虎：形式分析。朱晓敏：方法学。何西静：软件、形式分析。姜敏：资源。董伟良：监督、资源。刘家伟：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理。陈远涛：撰写——原始草稿、数据整理。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了多个来源的支持，包括中国国家重点研发计划（2023YFC3905002）、国家自然科学基金（22408168、22478184、U23A20126）、江苏省先进生物制造协同创新中心（XTB2203）、江苏省合成生物学基础研究基地（BK20233003）、江苏省基础研究计划（BK20250030）以及江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX25_1800）。

利益冲突声明

作者声明