1 INTRODUCTION
血管生成，即新血管的形成过程，是组织再生、创伤愈合和胚胎发育的核心。血管内皮生长因子（VEGF）是这一过程的关键调节因子，主要通过其受体酪氨酸激酶，特别是VEGFR2发挥作用。VEGF与VEGFR2结合后，可触发PI3K/Akt、Ras–Raf–MEK–ERK等下游信号级联反应，从而促进内皮细胞（EC）的增殖、迁移和存活。然而，基于VEGF的蛋白或基因疗法存在半衰期短、脱靶效应及可控递送困难等临床转化挑战。为克服这些局限，研究重点转向开发具有更好稳定性和生物利用度的VEGF模拟物及合成分子。近年来，人工智能（AI）和机器学习方法，特别是长短期记忆网络（LSTM），在从生物序列数据中学习模式方面展现出潜力，可用于辅助设计具有优化受体结合特性的生物活性肽。
2 RESULTS AND DISCUSSION
2.1 Peptide design and structural evaluation
研究团队采用了一种集成了LSTM序列建模、物理化学过滤和结构引导优化的AI辅助工作流，设计出了六个候选肽（VMP1–VMP6）。其中，VMP3在各项实验中均表现出稳定且可重复的促血管生成活性，因此被选为后续研究的先导肽。LSTM模型经过200个周期的训练，准确率在约50个周期后超过90%，表明其有效学习了VEGF模拟肽的序列级模式。分子动力学（MD）模拟显示，VMP3与已知的VEGF模拟肽QK具有可比的结构稳定性，其与VEGFR2复合物的均方根偏差（RMSD）值维持在0.5至1.9 nm之间，回转半径（Rg）在2.3至2.7 nm之间，表现出良好的紧凑性。MM/PBSA结合自由能计算表明，VMP3与VEGFR2具有强烈的相互作用，平均总结合能为-27.12 ± 4.14 kcal/mol，其中残基PHE3和VAL6对结合贡献显著。
2.2 Thermodynamic insights into the interaction between VMP3 and VEGFR2
分子对接显示VMP3有利地结合在VEGFR2的免疫球蛋白样D2结构域附近。为评估VEGFR2-VMP3复合物的稳定性，研究进行了三组重复的、时长为300 ns的分子动力学模拟。模拟结果表明，VMP3的结合在VEGFR2单体内诱导了构象扰动，这种扰动在受体结构域间传播，引发了结构域重组，从而调节了D2和D3界面处经典的VEGF-A识别口袋的结构。这些结构变化表现为口袋深度增加和静电互补性优化，与增强的配体-受体相互作用能量学一致。点突变实验（丙氨酸扫描）进一步验证了VMP3在D2结构域上的变构结合位点，突变关键残基ILE154和TYR209会导致结合能显著丧失。
2.3 Selection of VMP3 as the lead VEGF mimetic peptide
通过细胞增殖实验和VEGFR2 PathScan ELISA对六个候选肽进行功能筛选，发现VMP3能最有效地诱导内皮细胞增殖和VEGFR2磷酸化。进一步的细胞毒性（MTT）实验表明，在测试浓度范围内VMP3无明显细胞毒性。VMP3以剂量依赖的方式显著促进内皮细胞的迁移，在划痕愈合实验和Transwell趋化迁移实验中，其效果在1 μM浓度下与VEGF（30 ng/mL）和QK肽（1 μM）相当。计算得出VMP3促进增殖的半数有效浓度（EC50）值。使用一个在筛选中无活性的肽作为阴性对照，证实了VMP3的生物学活性依赖于其特定序列。
2.4 Biochemical and biophysical characterization of VMP3-VEGFR2 interactions
蛋白质印迹分析表明，VMP3处理可诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中VEGFR2及其下游效应分子PLCγ1、eNOS、AKT、GSK3β、JNK、p38和ERK1/2的磷酸化。VMP3与VEGF共处理可产生VEGFR2磷酸化的叠加增加，提示两者可能存在协同作用。使用VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼处理，可显著减弱VMP3诱导的VEGFR2及下游信号分子的磷酸化，证实了VMP3的信号激活是VEGFR2依赖性的。结合ELISA和PathScan ELISA定量证实了VMP3与VEGFR2的直接、剂量依赖性结合及其激活受体磷酸化的能力。表面等离子体共振（SPR）分析提供了直接的生物物理学证据，显示VMP3以纳摩尔级亲和力（KD= 1.60 nM）与VEGFR2结合，其结合力超越了对照肽QK。
2.5 Ex vivo angiogenesis and VEGFR2 signaling analysis using the mouse aortic ring assay
利用小鼠主动脉环离体模型评估VMP3的促血管生成潜力。结果显示，用VMP3（1和3 μM）处理可显著增强微血管出芽，在最大出芽前端距离、出芽厚度和总出芽面积等量化指标上均有显著增加。在3 μM浓度下，VMP3诱导的血管出芽在形态和程度上与VEGF处理组相当。对出芽微血管的蛋白质印迹分析显示，VMP3处理组的组织中磷酸化VEGFR2、AKT和ERK1/2等关键信号分子的表达水平上调，进一步在离体水平证实了VMP3通过激活VEGFR2通路促进血管生成。
2.6 Assessment of in vivo angiogenesis via the mouse Matrigel plug assay
通过小鼠基质胶塞体内实验评估VMP3的促血管生成活性。肉眼观察发现，经VMP3处理的基质胶塞呈现红色，表明有血管形成和血液灌注，而对照组则呈苍白透明。组织学（H&E）和免疫组化（CD31）分析证实，VMP3处理组中存在新形成的血管，CD31阳性区域密度和血红蛋白含量均呈剂量依赖性增加，其中3 μM VMP3的效果与VEGF相当。这些数据综合表明，VMP3在体内能有效促进功能性血管新生。
2.7 VMP3 promotes wound healing in diabetic mice
在链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠创面模型中，评估VMP3的治疗效果。与Vehicle对照组相比，局部应用VMP3可显著加速创面闭合，在第15天实现完全上皮再生。组织学分析显示，VMP3治疗促进了再上皮化、角质形成细胞和成纤维细胞增殖。CD31免疫染色表明，VMP3处理增强了创面组织内的新生血管形成，形成了致密连续的毛细血管网络。马松三色染色和天狼星红染色进一步显示，VMP3处理促进了胶原沉积和细胞外基质重塑，胶原纤维更粗、排列更整齐。这些结果表明，VMP3通过其VEGF模拟特性，激活血管生成信号通路并促进基质再生，从而有效改善糖尿病环境下的创面修复。
3 CONCLUSION, LIMITATIONS AND FUTURE DIRECTIONS
本研究成功利用AI辅助的LSTM框架设计并验证了一种新型VEGFR2激动肽VMP3。该肽在计算机模拟、体外、离体和体内多个层面均展现出与天然VEGF相似的促血管生成和加速创面愈合的生物活性。VMP3被鉴定为一种VEGFR2的部分激动剂，这为了解肽类物质调节血管生成信号的机制提供了见解。尽管前景可观，但VMP3作为肽类制剂，在体内稳定性、蛋白酶解易感性及药代动力学半衰期方面可能存在局限，其安全性和免疫原性也需要在相关生物体系中进一步评估。未来的研究可侧重于进一步阐明VMP3介导VEGFR2激活的结构和生物物理基础，评估其在更多缺血性或慢性损伤模型中的治疗效果，以推动其向血管再生和创面修复疗法的转化。
4 MATERIALS AND METHODS
4.1 Data collection
研究基于VEGF-A的17-25 α螺旋区域与受体结合的特性，通过MOE软件进行基序搜索，从PDB中收集了81条长度在8至20个氨基酸之间的非冗余肽序列，作为LSTM模型训练的数据集。
4.2 Training of recurrent neural network (RNN) and MD simulation
使用TensorFlow和Keras构建并训练了一个单层LSTM模型，包含64个记忆单元，通过嵌入层学习氨基酸的上下文表示。模型训练目标是预测序列中的下一个氨基酸。生成的候选序列经过物理化学性质（长度、净电荷、GRAVY值）过滤和基于已知VEGF模拟肽（如QK）的结构指导优化，最终选出6个肽（VMP1–VMP6）进行合成与实验评估。VMP3的序列为ARFLEVWQRTYCKA。分子动力学模拟使用CHARMM36力场和TIP3P水模型，在300 K下进行，分析了VMP3及对照肽QK与VEGFR2（PDB: 3V2A）结合的稳定性。
4.3 Experimental reagents and cell handling
详细列出了本研究中使用的化学试剂。VMP3和QK肽经HPLC和质谱验证纯度。实验使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），在无VEGF的内皮细胞基础培养基中培养。
4.4 Cellular functional assays
通过MTT法和台盼蓝排斥实验评估VMP3的细胞毒性和促增殖作用。通过划痕愈合实验和Transwell迁移实验评估VMP3对内皮细胞迁移的促进作用。
4.5 Evaluation of VEGFR2 phosphorylation and downstream signaling
通过蛋白质印迹分析检测VMP3对VEGFR2及其下游信号分子磷酸化的影响。使用PathScan ELISA试剂盒定量检测VEGFR2在酪氨酸1175位点的磷酸化水平。
4.6 Evaluation of VMP3 binding affinity and kinetics
采用结合ELISA评估VMP3与重组VEGFR2的直接结合。通过表面等离子体共振（SPR）技术精确测定VMP3与固定化VEGFR2结合的动力学参数和亲和力。
4.7 Mice
实验使用7周龄雌性C57BL/6J小鼠，所有动物实验均遵循Ajou大学动物护理与使用委员会批准的伦理指南进行。
4.8 Ex vivo evaluation of angiogenic potential
采用小鼠主动脉环实验评估VMP3的促血管生成活性。将小鼠主动脉环包埋于基质胶中，用含不同浓度VMP3的培养基培养，观察并量化微血管出芽情况。使用Wimasis图像分析平台对出芽参数进行定量。同时，对出芽组织进行蛋白质提取和蛋白质印迹分析，检测相关信号通路蛋白的表达。
4.9 In vivo analysis of angiogenesis through the mouse Matrigel plug assay
通过小鼠基质胶塞实验评估VMP3的体内促血管生成活性。将含有VMP3、VEGF、QK或Vehicle的基质胶皮下注射到小鼠侧腹，8天后取出基质胶塞，通过大体观察、血红蛋白含量测定、H&E和CD31染色分析新生血管情况。
4.10 Diabetes induction, wound model establishment, and peptide treatment
通过腹腔注射链脲佐菌素诱导小鼠1型糖尿病。在糖尿病小鼠背部制造全层皮肤切除伤口，局部应用不同剂量的VMP3、QK或Vehicle，定期拍照记录伤口闭合情况，并在实验终点取创面组织进行组织学分析（H&E、CD31、马松三色、天狼星红染色）。
4.11 Statistical analysis
使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。数据以均值±标准差表示，组间差异采用非配对Student's t检验和单因素方差分析进行评估，p < 0.05被认为具有统计学显著性。
