1. 引言
监测和监测项目在有效保护生物多样性和减轻人类健康风险方面发挥着关键作用，特别是在传染病频发的全球背景下。人畜共患传染病的增加使得家养动物和野生动物之间共享的疾病越来越多，对经济和人类健康构成了威胁。犬瘟热病毒（CDV）作为一种具有多宿主、全球分布和高遗传适应性的原型病原体，其传播与高死亡率和跨物种感染的高风险相关联。因此，监测项目为了解病毒的循环和出现提供了宝贵的见解，而整合监测，即在同一潜在宿主群体中针对多种病原体或将现有监测系统用于多重目的，已成为提高野生动物疫病监测效率和协调性的关键组成部分。CDV是一种单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科麻疹病毒属。尽管可以根据其H基因序列区分不同的毒株，但全基因组测序能更深入地洞察其进化动态和分子机制。CDV以其广泛的宿主范围而闻名，是动物健康和野生动物保护的已知威胁，在欧洲包括匈牙利在内的地区，已有多个物种（特别是鼬科动物）感染并死亡的记录报告。在匈牙利，红狐狸、金豺和家犬等多种犬科动物中都曾检测到CDV，已知在匈牙利流行的主要有三个谱系：欧洲谱系、欧洲野生动物谱系和类北极谱系。新一代测序（NGS）技术，特别是牛津纳米孔技术平台，凭借其实时测序分析能力，在低浓度病毒核酸样本的基因组测序中发挥着重要作用。本研究的目标正是调查CDV在匈牙利红狐狸和金豺中的存在情况，并通过基因组测序和系统发育分析来表征该病毒。
2. 材料与方法
2.1. 样本采集
研究共处理了来自260只红狐狸和16只金豺的552份口腔和直肠拭子样本。这些样本由匈牙利国家食品链安全办公室在2024年5月1日至8月1日期间，作为全国狂犬病监测计划的一部分，从匈牙利东部的五个州收集。所有样本均来自成年动物，且在采集时未表现出明显的临床症状。
2.2. 核酸提取与PCR反应
样本在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中均质化后，使用Quick-RNA Miniprep Kit提取核酸。所有核酸样本均通过CDV特异性实时RT-PCR检测病毒RNA的存在。使用Luna®Universal One-Step RT-qPCR Kit进行PCR反应，扩增程序包括55°C反转录10分钟，95°C预变性1分钟，随后进行45个循环的95°C变性、46°C退火和60°C延伸。PCR结果在MyGo Mini PCR系统平台上运行分析，Ct值自动确定。每个样本重复检测，并设置了阳性和阴性对照。
2.3. 纳米孔测序与生物信息学分析
采用实验室稍作修改的方案，在MinION平台上进行全基因组测序。首先使用SuperScript IV逆转录酶和随机六聚体从阳性样本合成cDNA。随后使用Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase和多重引物组生成重叠的扩增子。进行末端修复后，使用SQK-NBD114.96 Native Barcoding Kit制备文库，最终加载到MinION Mk1B设备的R10.4.1流通池上。使用Guppy软件进行碱基识别和解复用，序列质量用NanoPlot评估，通过NanoFilt按长度过滤读数，并用Minimap2比对。最终使用Medeka和r1041_e82_400bps_sup_g615模型生成抛光后的共有序列。
2.4. 系统发育树构建
从NCBI检索了1171条血凝素（H）基因序列，与本研究获得的序列使用MUSCLE进行比对。H基因序列的最大似然系统发育分析由IQTREE使用TVM + I + G4模型和1000次自举分析完成。生成的系统发育树最终在iTOL中进行编辑。
3. 结果
3.1. 实时RT-PCR筛查与测序
所有金豺样本检测均为阴性，而一只红狐狸的口腔和直肠样本中均检测到CDV RNA。该动物于2024年5月29日在Szabolcs-Szatmár-Bereg州的Nyírlugos镇被采集，口腔拭子的Ct值为28.5，直肠拭子为33.9。基于更高的病毒载量，选择口腔拭子进行测序。
测序得到了一个长度为4483个核苷酸的部分基因组序列，包含F基因3‘端、完整的H基因和L基因5’端，该序列已提交至GenBank。
3.2. 系统发育分析
尽管由于最终序列存在缺口，全基因组测序仅部分成功，但H基因的完整区域被成功恢复，得以与现有序列进行系统发育比较。基于H基因的系统发育分析，本研究鉴定的CDV毒株被确定为欧洲谱系成员。
该毒株与2017年从德国红狐狸中获得的一个序列亲缘关系最近。虽然该毒株也与2021年在匈牙利检测到的CDV序列聚类在同一个欧洲谱系中，但系统发育分析并未显示出紧密的遗传关系，且这些毒株来源于不同的时间点。
4. 讨论
在欧洲，红狐狸和不断扩张的金豺种群是威胁野生动物、家养动物甚至人类健康的病原体储存库。通过维持自我持续的感染循环，这些野生犬科动物促进了人畜共患寄生虫和细菌的溢出。在病毒性疾病方面，尽管狂犬病在西欧已被口服疫苗接种基本清除，但在东欧仍然流行。犬细小病毒和CDV则在地理上广泛传播。野生犬科动物携带和排出高病毒载量却不表现出即时症状，这对与其共享环境且未接种疫苗的家犬构成了持续的感染风险。野生动物迁移、城市化与食腐行为、非法宠物贸易等因素加速了与野生犬科动物相关病原体的传播，凸显了在匈牙利及中欧、东欧的特定野生动物监测环境中，建立一个整合监测系统以填补数据空白、更好地追踪病原体在野生犬科动物中传播的必要性。
本项先导研究证明了在匈牙利东北部地区的红狐狸种群中，CDV依然存在。在260只接受检测的红狐狸中，有1只呈CDV阳性，而16只金豺样本均为阴性。这一结果表明，在基于被动监测（如狩猎采样）的项目中，样本量优化对于检测低流行率病原体至关重要。例如，为了在约1%的流行率水平上以95%的置信度检测到至少一例阳性，需要检测大约300份样本。本研究对红狐狸的检测样本量已接近此要求，这使研究者能够洞察晚春至初夏时期CDV的传播情况。而对于金豺，样本量低于最优水平，需要更大的样本量才能对其种群中的CDV流行率得出有意义的结论。相反，在疾病暴发期间，阳性率可能更高，此时可能只需更少的样本就能识别病毒的局部传播。
基于H基因的系统发育分析，本次鉴定出的单个CDV毒株被归类为在欧洲自由生活的食肉动物中广泛传播的欧洲谱系，这对野生动物保护构成了已知风险。该研究毒株显示出与2017年德国红狐狸中检测到的CDV毒株最高的相似性，并与德国和丹麦从2000年代末至2020年代检测到的其他CDV毒株聚类。有多个报告指出，欧洲谱系CDV感染了包括德国和瑞士的欧亚猞猁、西班牙的伊比利亚猞猁、匈牙利的欧亚水獭和草原雪貂在内的多种受威胁物种。不仅如此，该谱系也影响了许多非受威胁物种，在德国、丹麦、意大利和瑞士的狐狸、獾、浣熊、貉、石貂等多种动物中均有发现。此外，该谱系也感染了家犬，表明CDV不仅对野生动物保护构成威胁，也对伴侣动物构成威胁。
在Nyírlugos的红狐狸体内发现欧洲谱系CDV毒株，鉴于采样点靠近罗马尼亚和乌克兰边境，可能暗示了跨境野生动物迁徙在CDV区域性传播中的作用。然而，由于罗马尼亚和乌克兰野生动物CDV序列的公开数据缺失，以及匈牙利本地伴侣动物中流行毒株的分子特征信息有限，目前还无法明确追踪感染途径或确认这些疑似跨境联系。鉴定毒株与德国和丹麦毒株的遗传相似性表明，该谱系可能在欧洲大陆广泛但零星分布。这凸显了采取更全面、整合的基因组监测方法，以识别共循环病原体并弥合家养和野生动物健康之间数据空白的迫切需求。
本研究也存在一些局限性。由于样本质量等原因未能获得完整的基因组序列，因此仅限于对H基因区域的系统发育分析。缺乏采样动物的临床信息，无法记录任何相关的临床症状。此外，CDV的检测基于单个阳性样本，限制了更广泛的流行病学推断。尽管如此，本研究为一个代表性不足的地区提供了有价值的分子数据，有助于理解CDV在欧洲的遗传多样性。
5. 结论
CDV广泛的宿主范围凸显了需要进一步研究以更好理解其传播和致病机制。基于整合方法的监测为区域性病原体的传播和分布提供了宝贵信息，从而支持野生动物保护和疾病暴发预防。本研究证实，获取遗传数据对于理解具有流行病学重要性的病毒至关重要。通过一个整合监测系统，本研究旨在展示该地区的一种新方法，即病毒监测可以在不启动单独项目的情况下实现，并且考虑到扩大系统规模可能面临的资金、实验室标准化和数据共享等实际挑战，现有的技术背景足以支持有效的基因组监测。
