微运动摩擦微球通过按摩细胞来促进界面组织的融合与再生

本研究开发了一种基于微流控和光聚合技术的羟基磷灰石-四环素共轭水凝胶微球，通过静电和空间排斥作用提供稳定的细胞-组织界面机械保护，实现微-纳米级动态摩擦调控。早期通过微米级滚动润滑（摩擦系数0.028-0.072）释放抗炎因子抑制炎症，后期通过内源性透明质酸酶触发自分解，提供纳米级水合润滑（0.027-0.078）并完全释放促骨再生因子，促进骨隧道增殖和界面组织融合再生。体内实验证实其可有效上调ECM合成并增强功能生物因子分泌，为组织再生提供创新机械工具。

胡媛|姚世一|齐芒古丽·赛丁|雷翔|王臻|蔡正伟|叶廷军|邓连福|雷翔|崔文国

上海交通大学医学院瑞金医院创伤与骨科研究所骨与关节疾病预防与治疗重点实验室骨科，中国上海市瑞金二路197号，200025

摘要

微动摩擦是一种新型的生物力学刺激方法，它通过对细胞施加微小的机械力来模拟自然的生物力学环境，从而增强细胞的生理活性。在本文中，我们结合了微流控技术和光聚合技术，制备了一种由羟基磷灰石和多西环素与甲基丙烯酸化透明质酸聚阴离子水凝胶微球耦合而成的微动摩擦装置，这些微球的直径约为150微米。通过静电和空间排斥作用，这些微球在细胞-组织界面提供了稳定的机械按摩保护，并能够调节从微米到纳米尺度的微动摩擦强度。研究表明，微动摩擦能够有效刺激细胞活性，从而支持前交叉韧带重建过程中的界面组织融合与再生。在早期和中期阶段，微球提供微米级别的滚动润滑（摩擦系数：0.028–0.072），同时缓慢释放抗炎因子以减轻炎症；在后期阶段，关节内的内源性透明质酸酶会引发微球的自分解，转变为纳米级别的水合润滑（摩擦系数：0.027–0.078），最终完全释放组织生长因子以促进骨隧道的增殖。体内实验表明，这些微球能够诱导细胞外基质的合成和微动摩擦相关功能因子的分泌，从而促进界面组织的融合与再生。具有主动按摩功能的微动摩擦微球显著增强了细胞的合成活性，为组织再生提供了一种有前景的方法，同时也展示了一种用于再生医学的新型机械工具。

引言

微动摩擦是一种新型的生物力学刺激技术，它通过对细胞表面施加微小的机械力来模拟体内的生物力学环境[1]。这种方法能够增强细胞的生理活性并促进功能因子的分泌[2][3][4]。本质上，微动摩擦是一种有益于细胞健康的机械刺激疗法[5][6][7]。研究表明，微动（即受损组织界面之间的可控微小运动）是促进界面组织愈合的关键机械参数[8][9]。MoTrPAC团队证明持续的运动可以调节免疫系统和新陈代谢[10]。Yu等人发现，在小鼠活跃期的早期运动能够激活与骨骼发育和代谢相关的基因，从而促进骨骼生长[11]。使用可控强度的自动按摩设备对受损肌肉区域进行的体外研究也显示了组织再生的增强[12]。临床证据表明，机械按摩可以减轻炎症并加速组织修复[12]。这些发现强调了微动摩擦技术在细胞水平上增强机械抵抗力和引导治疗性细胞向组织再生方向的潜力。 多种基于生物材料的微动摩擦策略已被应用于组织再生。基于溶液的微动摩擦方法操作简单[13][14][16]，但由于注射后快速泄漏而限制了其组织修复效果。基于纳米颗粒的微动摩擦策略[17]虽然具有创新性，但受到细胞吞噬作用的阻碍。目前改进受损组织再生的努力主要集中在使用水凝胶或涂层在原位制备微动摩擦修复层[4][18][19]。Tay等人设计了具有动态可调机械特性的水凝胶，以促进细胞外基质（ECM）的重塑和组织再生[20][21][22][23]；Xiang等人开发了一种通过润滑微环境促进组织再生的水凝胶贴片[24]。然而，传统的水凝胶无法为细胞提供足够的微动摩擦点，限制了细胞的有效合成和组织再生。此外，它们的微动摩擦性能会随时间退化，产生磨损碎片，可能加剧组织损伤。相比之下，水凝胶微球具有更好的分散性、更大的比表面积、更好的注射性能和持续的微动摩擦效果，因此在组织再生应用中受到了广泛关注[2][24][25][26]。 前交叉韧带（ACL）重建失败是一个全球性的公共卫生问题，其根本原因是移植物与骨隧道之间的ECM合成/代谢不平衡，导致ECM降解和生理界面组织形成受损[27][28][29][30]。类似的界面组织损伤特征也出现在临床骨折、骨缺损以及其他运动（如肩袖撕裂、皮肤裂口和脊髓损伤）引起的损伤中。如果不及时干预，这些情况可能会发展为不可逆的组织损失。ACL重建后，肌腱-骨界面的生理愈合包括四个复杂阶段：炎症、软骨结痂形成、硬结痂形成和重塑。适当的微动摩擦对于维持骨组织稳态和促进基质及矿物质的沉积至关重要。最近的临床证据表明，生理适宜的机械训练和持续的康复锻炼可以降低ACL重建手术的失败率，并抑制相关的并发症（如骨关节炎）[29]。Ingram等人证明，对膝关节施加的被动循环机械运动能够促进细胞生长因子的分泌，并补充关节固定期间丢失的营养物质[31]。虽然微动摩擦激活的组织和细胞再生在ACL重建失败的治疗中显示出潜力，但过度的微动摩擦可能会抑制移植物和周围组织的生理愈合，从而加剧损伤和退化[18]。因此，微动摩擦需要根据组织再生的不同阶段进行定制，以促进ECM合成和功能因子的释放，从而恢复组织的生理再生。基于微流控技术的微动摩擦微球具有较大的比表面积、高亲水性和微/纳米孔结构，能够在不同阶段为细胞提供更多的机械摩擦接触。 在这项研究中，我们创新性地制备了聚阴离子透明质酸微动摩擦水凝胶微球，作为结合微流控技术和光聚合技术的机械刺激平台。这些微球通过静电和空间排斥作用在细胞-组织界面提供了稳定的机械保护，实现了从微米到纳米尺度的微动摩擦（图1a-c）。我们对微球润滑行为的研究表明，它们在组织愈合的早期和中期阶段提供了微米级别的滚动和水合润滑（摩擦系数：0.028–0.072），同时缓慢释放抗炎因子以有效消除移植物和骨隧道界面上的炎症；在愈合后期，微球通过关节内的内源性透明质酸酶自分解，转变为纳米级别的水合润滑（摩擦系数：0.027–0.078），并完全释放组织生长因子以促进移植物界面的骨隧道增殖。使用大鼠ACL重建模型的体内实验表明，这些微动摩擦微球为细胞形成了临时的主动按摩点，上调了ECM的合成，并促进了移植物和骨隧道之间功能生物因子的分泌。

甲基丙烯酸化透明质酸的合成与表征

甲基丙烯酸化透明质酸的合成方法参照了先前报道的方法。简要来说，将2%（重量百分比）的透明质酸（M_W = 34.5 kDa；华西生物科技有限公司，济南）加入去离子水中，与甲基丙烯酸酐（摩尔过量2.6倍；Aladdin，上海）在pH 8.0条件下反应。反应溶液在冰浴中连续搅拌24小时后，通过透析（分子量截留范围8000-10000 Da）进行纯化，纯化过程持续三天。

微动摩擦微球的制备与表征

我们制备了具有微动摩擦功能的微凝胶微球，以促进ACL重建，这些微球的设计旨在匹配生物界面组织的特性，并完美模拟ECM的特性。使用同轴微流控技术制备了具有可调微动摩擦水平的聚阴离子透明质酸（HA）水凝胶微球（简称H）。随后，将羟基磷灰石（P）和多西环素（D）分别与这些微球结合（PH和DPH）。

结论

在这项研究中，我们提出了新型的微动摩擦微球，旨在主动按摩细胞并引导细胞合成以促进组织再生。这些微球通过静电和空间排斥作用在细胞-组织界面提供稳定的机械保护，能够调节从微米到纳米尺度的微动摩擦强度。体外和体内实验验证了它们的功能性。在组织愈合的早期和中期阶段，微球...

CRediT作者贡献声明

胡媛：撰写——原始草稿，软件开发，数据管理。 姚世一：撰写——原始草稿，验证，数据管理。 齐芒古丽·赛丁：方法学设计，实验研究。 雷翔：撰写——审稿与编辑，项目管理，资金筹集。 崔文国：撰写——审稿与编辑，项目管理，概念构思。 邓连福：撰写——审稿与编辑，资金筹集。 雷翔：验证，数据分析。 王臻：软件开发，方法学设计。 蔡正伟：数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：52305206）、上海浦江计划（23PJD056）的支持，以及CPSF博士后奖学金计划（项目编号：GZC20231623）和博士后奖学金计划（2024M752001, 2024T170570）的资助。