按需释放硫化氢的水凝胶能够重新调节糖尿病伤口的微环境，从而加速伤口愈合

糖尿病慢性伤口修复中，基于胶原蛋白、羧甲基壳聚糖和鞣酸的多功能水凝胶（CCT@HSD）通过ROS响应释放H2S，实现抗菌、抗氧化、免疫调节和血管生成协同作用，加速伤口愈合，并在猪等动物模型中验证其高效性和安全性，代谢组学揭示调控代谢通路的分子机制。

杨哲|任柳娇|何天|杨鹏飞|刘新阳|迪晨娜|王荣华|高迪|金琳|李成伟|田忠民

中国西安交通大学生命科学技术学院，教育部生物医学信息工程重点实验室，西安，710049

摘要

慢性糖尿病伤口常常由于过量的活性氧（ROS）、持续的炎症和血管生成障碍而发展为感染、截肢和高死亡率。硫化氢（H₂S）可以促进血管生成，增强抗氧化防御，并驱动巨噬细胞向修复型M2表型转化，但其临床应用受到不稳定性和毒性的限制。我们开发了一种多功能水凝胶（CCT@HSD），由胶原蛋白、羧甲基壳聚糖和单宁酸组成，并加入了一种对ROS有响应的H₂S供体（HSD），以实现按需释放。这种水凝胶具有抗菌、抗氧化、促进血管生成和调节免疫的功能，有效重塑了伤口微环境。它加速了止血过程，在1小时内清除了MRSA，并促进了内皮细胞迁移，同时表现出优异的血液相容性和生物降解性。重要的是，在多种糖尿病动物模型中观察到了强大的促愈效果，包括皮肤结构更接近人类组织的猪糖尿病伤口模型，从而进一步证明了其竞争优势和转化潜力。代谢组学分析揭示了嘌呤、氮、叶酸和硒代谢的多种变化，其中丙酮酸和叶酸等关键代谢物与血管生成和免疫调节呈正相关。总体而言，CCT@HSD水凝胶通过结合抗菌、抗氧化和代谢重编程实现了高质量的伤口修复，显示出对难治性糖尿病伤口的强大转化潜力。

引言

2021年，全球有超过5.3亿人患有糖尿病，到2045年这一数字将增加到7.8亿[1]。慢性糖尿病伤口是糖尿病最严重的并发症之一，尤其是糖尿病足溃疡（DFUs），这些溃疡使患者容易发生严重感染，显著降低生活质量，甚至导致截肢或死亡[2,3]。尽管临床管理有所进展，但这些传统治疗方法仍不足以改善这类难治性伤口的修复[4,5]。因此，迫切需要开发能够有效应对糖尿病伤口复杂病理环境的创新策略。

慢性糖尿病伤口的进展在很大程度上是由严重失调的微环境驱动的[6,7]。持续的高血糖和慢性炎症导致活性氧（ROS）过度积累，对伤口床造成严重的氧化应激[8]。升高的ROS直接损害成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞，影响其存活和功能。结果，诸如肉芽组织形成、再上皮化和血管生成等关键过程受到显著抑制[9]。同时，过量的ROS还会使巨噬细胞向促炎型M1表型转化，产生高水平的炎症细胞因子，进一步阻碍伤口修复[10,11]。此外，高血糖促进细菌过度生长，而糖尿病患者的免疫防御能力下降，增加了反复感染的风险[12]。这些感染加剧了炎症并加剧了组织破坏，形成了一个恶性循环，进一步延迟了愈合过程。因此，糖尿病伤口的特点是氧化损伤、持续炎症和感染风险的叠加，共同严重阻碍了愈合过程。

硫化氢（H₂S）作为第三种内源性气体信号分子[13]，在调节伤口愈合中起着关键作用[14,15]。在慢性糖尿病伤口中，H₂S水平明显降低，表明其缺乏与修复能力受损密切相关[16]。值得注意的是，外源性H₂S的补充已被证明可以加速糖尿病模型中的伤口愈合。H₂S的治疗益处是多方面的[17,18]。它促使巨噬细胞从促炎型M1表型向抗炎型M2表型转化，抑制细胞因子的产生并缓解慢性炎症[19]。此外，H₂S通过硫醇化途径增强细胞抗氧化防御，促进过量ROS的清除，减少氧化损伤，并刺激血管生成[20]。尽管有这些有希望的效果，但H₂S的临床转化仍具有挑战性。由于其高挥发性、在生物系统中的半衰期短以及由于释放不受控制而可能产生的高浓度毒性，通过直接给药维持治疗所需的安水平度十分困难。因此，迫切需要开发能够在伤口部位时空可控释放H₂S的策略，以确保疗效和安全性。

水凝胶作为一种三维聚合物网络，具有高含水量，可以紧密贴合伤口表面，创造有利于组织修复的湿润微环境[[21], [22], [23], [24], [25]]。通过调整聚合物组成和交联策略，可以精细调节其机械性能、粘附性和降解动力学，从而适应多种临床应用。来自生物大分子的水凝胶通常具有内在的生物活性[26,27]。例如，重组人胶原蛋白保留了Arg-Gly-Asp（RGD）粘附基序，有助于成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞的粘附和增殖，从而加速肉芽组织形成和再上皮化[28,29]。此外，水凝胶的多孔结构为整合治疗剂（如抗菌剂、生长因子和药物）提供了多功能平台[30]。这一优势支持了治疗剂的局部和持续释放，提高了治疗效果，同时最小化了全身副作用。这些特性使水凝胶成为非常有前景的伤口敷料平台。然而，大多数市售产品（如IntraSite™ Gel）仍仅限于被动作用，主要是保持湿度和物理覆盖。这种有限的功能性不足以应对糖尿病伤口的多因素病理，需要协调的抗菌、抗炎、抗氧化和促再生干预。因此，当前水凝胶敷料的治疗效果仍然有限，迫切需要能够主动调节伤口微环境的下一代工程化水凝胶。

在这里，我们开发了一种多功能复合水凝胶，旨在主动重塑糖尿病伤口微环境（图1）。该系统使用重组人胶原蛋白和羧甲基壳聚糖作为结构基质，通过多种非共价作用（如静电相互作用、氢键、疏水相互作用、π-π堆积、阴离子/阳离子-π相互作用）与天然多酚单宁酸（TA）交联，并整合了一种对ROS有响应的H₂S供体（HSD）作为治疗载荷。这种设计赋予了水凝胶几个独特的优势。首先，羧甲基壳聚糖增强了基于胶原蛋白的网络并减缓了其降解，从而延长了敷料的功能寿命。此外，其阳离子基团通过静电相互作用加速了止血并破坏了细菌膜，赋予了广谱抗菌活性。其次，TA通过化学交联和氢键增强了网络，显著提高了粘附性并降低了敷料移位的风险。第三，嵌入的ROS响应性HSD能够在氧化性伤口环境中控制H₂S的释放，维持治疗浓度同时防止与过量H₂S相关的细胞毒性。最后，从水凝胶中释放的H₂S还促进了巨噬细胞向修复型M2表型的转化，抑制了慢性炎症，促进了向增殖阶段的转变，并刺激了血管生成。因此，与其他释放H₂S的水凝胶敷料[18,31,32]相比，本研究中的CCT@HSD水凝胶旨在通过单一治疗平台同时满足糖尿病伤口护理的主要治疗需求，包括快速止血、广谱抗菌活性（包括耐甲氧西林的S. aureus，MRSA）、ROS清除、炎症缓解（巨噬细胞重编程）、血管生成和组织再生。

总之，这种按需释放H₂S的水凝胶不仅克服了传统基于胶原蛋白的水凝胶的物理化学限制，还在整个伤口愈合过程中提供了协同的生物调节作用，包括止血、感染控制、炎症缓解和组织再生。重要的是，在多种糖尿病动物模型中观察到了强大的促愈效果，包括皮肤结构更接近人类组织的猪糖尿病伤口模型，从而进一步证明了其在难治性糖尿病伤口中的竞争优势和转化潜力。

细胞、细菌和动物

成纤维细胞系（L929）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和小鼠巨噬细胞样细胞（RAW 264.7）来自中国科学院细胞库。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在含有5% CO₂的湿润培养箱中于37°C下维持。

大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和耐甲氧西林的S. aureus

按需释放硫化氢水凝胶的制备和表征

一种典型的ROS响应性H₂S供体（HSD），PeroxyTCM-3，已合成（补充图1a），并通过¹H NMR（400 MHz，DMSO‑d₆；δ 1.30, 5.56-5.62, 7.33-7.69 ppm；补充图2）进行了表征。此外，与HSD相比，HSD与H₂O₂反应后的光谱显示在δ 6.77-6.66 ppm处出现了新的芳香质子信号，同时δ 5.62-5.56 ppm处的特征信号明显减弱（补充图3）。这表明

结论

总之，我们开发了一种多功能按需释放H₂S的水凝胶（CCT@HSD），通过整合广谱抗菌活性、强效ROS清除、可控的H₂S释放和免疫调节，积极重塑了慢性糖尿病伤口的病理微环境。该系统不仅减少了细菌负担和氧化应激，还促进了巨噬细胞向修复型M2表型的转化，增强了血管生成，并刺激了

CRediT作者贡献声明

杨哲：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，资金获取，概念构思。任柳娇：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，数据分析。何天：撰写 – 原稿，验证，方法学，研究，数据分析。杨鹏飞：撰写 – 审稿与编辑，研究，资金获取，概念构思。刘新阳：验证，方法学。迪晨娜：验证，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了陕西三秦人才专项青年拔尖人才支持计划（2023STZZK09）、中央高校基本科研业务费（xzy012023002 和 sxzy012025067）、国家自然科学基金（82370726 和 82500872）、陕西省自然科学基金（2024JC-YBMS-272 和 2025JC-YBQN-1193）、陕西省博士后科学基金（2023BSHYDZZ05 和 2024BSHYDZZ003）和博士后奖学金的支持