基于蛋白质组学分析白藜芦醇对醋酸杆菌（Acetobacter sp.）的损伤机制，以及其与脉冲电场联合使用时的灭活效果

研究揭示了天然多酚槲皮素（RES）破坏醋酸菌细胞膜完整性与流动性的机制，通过蛋白质组学发现其抑制蛋白质表达与代谢通路，同时结合脉冲电场（PEF）可显著增强杀菌协同效应，证实膜损伤指标（相对电导率、细胞内容物泄漏、死亡率）升高。

董一帆|陈思宇|任二芳|盖莉莉|韩忠|程俊虎|曾新安|周伟正|郑莉|牛德宝

广西大学轻工与食品工程学院，南宁，530004，中国

摘要

醋酸杆菌是葡萄酒酿造过程中的主要腐败微生物。本研究基于蛋白质组学研究了内源性白藜芦醇（RES）对醋酸杆菌的抑制机制及其与脉冲电场（PEF）联合处理的灭活效果。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和荧光偏振实验表明，醋酸杆菌细胞膜在暴露于RES后完整性受损，膜流动性增加，从而抑制了细菌的存活和生长。同时，观察到RES与膜蛋白相互作用，导致微环境中苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基的亲水性增强。无标记蛋白质组学分析显示，RES通过影响与细胞结构、翻译和环境适应性相关的蛋白质来抑制醋酸杆菌的生长。RES处理后，醋酸杆菌细胞中的7条KEGG通路受到显著影响。RES与PEF联合处理显著增强了细菌的灭活效果，联合处理导致膜损伤明显，表现为相对电导率升高、细胞内物质泄漏和死亡率增加。相对电导率的升高、细胞内物质的泄漏以及更高的死亡率表明联合处理对细胞膜造成了严重损伤。

引言

醋酸杆菌是葡萄酒酿造中常见的腐败细菌，能够通过酶促氧化将乙醇转化为乙酸，导致葡萄酒的挥发酸度显著增加，严重影响其感官品质和商业价值（Valera等人，2017年）。目前，二氧化硫（SO₂）仍然是葡萄酒酿造中广泛使用的抗氧化剂和抗菌剂，但其对醋酸杆菌的抑制作用有限，过量使用可能带来潜在的健康风险（Feng等人，2024年；Yang等人，2024年）。因此，开发绿色、低毒性和有效的微生物控制技术对于促进葡萄酒产业的可持续发展具有重要意义。

白藜芦醇（RES）是一种天然多酚化合物，存在于葡萄等植物中，因其广泛的抗氧化、抗菌和抗癌活性而受到关注（Ren等人，2025年；Zhang等人，2024年）。大量研究表明白藜芦醇具有抗菌潜力，能够有效抑制细菌、真菌和病毒的生长（Vestergaard和Ingmer，2019年）。然而，其对醋酸杆菌的具体作用机制仍有待系统阐明。脉冲电场（PEF）是一种新兴的非热处理技术，适用于液态食品中有害微生物的灭活（Feng等人，2022年；牛德宝等人，2024年）。据报道，该技术可以有效控制果汁和牛奶等商业食品中的微生物（González-Arenzana等人，2019年；Ozkan等人，2025年）。值得注意的是，PEF处理可能对细菌造成亚致死性损伤，使它们在适宜条件下恢复并生长。此外，高强度PEF处理对设备要求较高，并可能因欧姆热效应而对质量产生负面影响（Timmermans等人，2019年）。

本研究旨在阐明RES对醋酸杆菌的损伤机制，并评估其与PEF联合处理的灭活效果。首先测量了RES对细菌生长的抑制作用，并分析了其对细胞膜和细胞内大分子（蛋白质和DNA）的影响。进一步利用无标记蛋白质组学技术分析了RES诱导的细胞结构、代谢和环境适应性相关蛋白质的表达变化。在此基础上，评估了RES与PEF联合处理的效应，并通过细胞存活率、膜通透性和细胞内泄漏等指标揭示了其协同抗菌效果。

材料

白藜芦醇（RES，纯度≥99%）购自Sigma-Aldrich（中国上海），溶解在二甲基亚砜（DMSO）中后储存在-20°C。

醋酸杆菌及培养基

醋酸杆菌菌株来自自制的红葡萄酒，在YGC琼脂平板上培养（Valera等人，2013年）。将平板倒置后在37°C的培养箱中培养48小时。向YG液体培养基（北京Solarbio科技有限公司，北京）中加入4%（v/v）的乙醇，然后将选定的菌落接种到液体培养基中。

CLSM观察

SYTO可以穿透完整和受损的细菌细胞并发出绿色荧光，而碘化丙啶（PI）仅能穿透膜受损的细胞并发出红色荧光，从而指示膜损伤。结合SYTO/PI染色的CLSM检测适用于评估醋酸杆菌的膜完整性（Wang等人，2022年）。如图1所示，对照组主要显示绿色荧光，表明大多数细胞膜保持完整

结论

本研究评估了白藜芦醇（RES）对醋酸杆菌的损伤机制及其与脉冲电场（PEF）联合处理的灭活效果。CLSM染色和DPH荧光偏振结果表明，RES导致膜完整性受损和膜流动性改变，伴随细胞内成分的泄漏。无标记蛋白质组学进一步表明，RES通过影响参与细胞

CRediT作者贡献声明

牛德宝：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。周伟正：软件，方法学，概念设计。郑莉：验证，方法学，正式分析。盖莉莉：撰写 – 审稿与编辑，验证，概念设计。韩忠：监督，项目管理，数据管理。程俊虎：资源，正式分析，数据管理。曾新安：资源，项目管理。董一帆：撰写 – 初稿，软件，正式分析。陈思宇：

未引用参考文献

Hou等人，2021年；Niu等人，2024年；Niu等人，2024年。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了广西壮族自治区科学技术计划项目（AD23026214）、国家自然科学基金（32572749、32102133）、广西壮族自治区自然科学基金（2022GXNSFAA035559）以及中国现代农业产业技术体系大豆和油料作物创新团队项目（nycytxgxcxtd-2023-23-03）的支持。