1 引言
学习地点意义的能力使个体能够形成并维持与特定经历相关的位置记忆，这种适应性和情境适宜的记忆通常持续终生。主动位置回避（Active Place Avoidance, APA）任务被用于评估啮齿类动物的空间认知和长时程记忆。该任务至少依赖于完整的海马功能一个月，并能引起海马突触功能的月尺度变化，这些变化可在训练后1-30天在离体脑片中测量。APA学习还会改变内侧内嗅皮层至上叶片齿状回（DG）的突触群体，在单次30分钟训练后以及长达60天的清醒行为小鼠中均可测量到。
与长时程增强（LTP）相关的几种分子在海马背侧被瞬时激活，包括Ca2+ -钙调蛋白激酶II（CaMKII）和非典型蛋白激酶C（aPKC）亚型PKC𝜄/λ，它们对条件性回避的获取至关重要。与之相对，另一种aPKC——蛋白激酶Mζ（PKMζ）及其相互作用伙伴支架蛋白KIBRA（由Wwc1基因编码）的持续性激活，对于维持增强的突触和记忆是必需的。PKMζ的活性由其丰度调节，其持续性增加对于至少一个月的长时程记忆是必要的，这已在不同脑区、物种和记忆范式中得到证实。
然而，哪些突触群体随经验发生持续性变化仍是一个开放性问题。一种假说认为，这些变化主要发生在与记忆维持相关的那些突触群体中。另一种假说则认为，记忆相关变化以非特异性的结构组织发生在各处。海马CA3亚区的大量循环连接性使其可能作为一个具有强健记忆相关突触可塑性的储存位点。
像PKMζ这样对记忆维持至关重要的分子，以多种方式与其他结构、效应和调节分子相互作用，这些相互作用尚未完全确定，但最好被抽象为从分子成分列表中提取出的相互作用网络。尽管维持持续性位置回避记忆的完整分子相互作用网络尚属未知，但生化研究表明，PKMζ与肾脏和脑蛋白（KIBRA/WWC1）在寡聚复合体中结合，该复合体将PKMζ定位到突触后位点，并通过激活N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）来增强突触传递，进而增加含有GluA2亚基的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）型谷氨酸离子受体的插入。这一过程与由CaMKII活性/结构维持的、蛋白与C激酶1（PICK1）协调的、NUMB介导的AMPA受体内存作用的磷酸化依赖性减少相吻合和整合。
这些过程在很大程度上是在转录后水平（包括mRNA翻译和蛋白质稳定性调控）上调节，还是伴随着这些基因mRNA水平的变化（可能以相反的方向，例如PICK1和NUMB的功能与PKMζ、KIBRA、NSF、CaMKII和GluA2的记忆促进细胞生物学功能相反），尚不清楚。此外，LTP诱导与另一种aPKC（PKC𝜄/λ）的瞬时上调相关，而PKMζ基因Prkcz的基因缺失会导致LTP和记忆触发的补偿性PKC𝜄/λ以及常规亚型PKC𝛽1的上调延长。
现代基因组学技术如转录组谱分析使得检查动物行为可塑性的分子基础成为可能，并可有效地用于检验关于记忆维持分子基础的特定假设，以及发现新的通路用于后续实验分析。
在本研究中，我们使用主动位置回避作为长时程记忆维持的范例，进行了两个独立的实验。实验1使用免疫组织化学（IHC）和海马背侧回路内感兴趣区域（ROI）的定量分析，检验了PKMζ通过定位到海马亚区EYFP标记的记忆相关细胞的特定细胞亚区室来发挥其记忆维持作用的假设。实验2使用特定海马亚区的批量RNA测序（RNA-seq），检验了PKMζ系统以及其他几个候选基因的转录调控对APA范式中记忆维持至关重要的假设。最后，我们从DG、CA3和CA1获得的RNA-seq数据中挖掘了可预测记忆和PKMζ基因表达水平的共变分子网络，这里以PKMζ作为具有关键功能（如记忆维持）但差异表达水平极低、限制了其通过标准差异基因表达（DEG）或线性相关分析检测的蛋白质范例。
不同于源自未知开放阅读框和DNA序列的所谓“暗蛋白质组”，我们将这类对记忆持久性至关重要但未被转录组谱分析和其他无偏组学筛查检测到的分子称为“影子蛋白质组”。利用线性和非线性相关度量，我们开发了一种新的分析流程——相关信号共聚类降维（C-SCoRe），以识别分子相互作用在受到扰动（如记忆训练）后如何变化。C-SCoRe利用基因表达值之间的受试者内相关性，而不是它们的丰度。如所使用的那样，它选择与行为记忆测量相关的基因，并将基因-基因相互作用变化的大型网络投影到由其协方差定义的低维空间中。C-SCoRe能够预测观察到的PKMζ基因表达与记忆持久性之间的关系，验证了其实用性，并证明了即使在无法检测到差异基因表达水平时，检测影子蛋白以及潜在地识别与记忆维持相关的新的分子相互作用和通路的可行性。
2 结果
2.1 实验1 – 追踪记忆
2.1.1 PKMζ蛋白在记忆标记细胞中持续增加至少30天
经过训练和未训练的ArcCreERT2 x ChR2-EYFP TRAP2转基因小鼠在预训练后不久进入电击区的行为没有差异，但只有训练组小鼠在训练结束时学会延迟进入电击区数分钟。这种条件性回避持续存在，并在一个月后的无电击保留测试中表达。
在存在4-羟基他莫昔芬的情况下，即刻早期基因Arc的神经元激活导致神经元在Ammon角的锥体细胞中永久表达EYFP标签。我们首先将体细胞EYFP信号（在CA1、CA2、CA3的str. pyramidale和DG的颗粒细胞层）与树突区室ROI的信号相关联，以评估EYFP标签是否分布在定义突触区室的各层中。在每个海马亚区内，我们观察到体细胞ROI的EYFP表达与每个相应的树突ROI之间存在强正相关。
接下来，我们确定记忆训练是否导致每个海马亚区的EYFP表达升高。相对于对照表达值，训练组在CA1、CA3、上DG和下DG的EYFP表达显著增加，但在CA2没有。
我们使用记忆训练诱导的ChR2-EYFP标签增加及其与PKMζ的共表达，来研究哪些记忆相关突触群体在记忆训练后可能具有持续增加的PKMζ表达。由于其在维持突触增强中的作用，我们使用ROI中的PKMζ-EYFP重叠作为估计与记忆相关的持续性增强突触群体的代理。与未训练组相比，PKMζ在训练组上DG的所有ROI中均显著增加。专门在表达PKMζ位点估计PKMζ-EYFP重叠的Manders M1系数在训练组和未训练组之间没有显著差异。相比之下，专门在表达EYFP位点估计PKMζ-EYFP重叠的M2系数在训练组小鼠的颗粒细胞层ROI、中间分子层ROI和外分子层ROI中显著增加，但在内分子层ROI中不显著。这表明上DG分子层外三分之二的突触在记忆训练一个月后持续增强，这与外侧内嗅皮层II层（LECII）和内侧内嗅皮层II层（MECII）输入在上DG终止的位置一致。
对下DG的相应分析发现，训练组与未训练组相比，仅在中分子层和外分子层ROI的PKMζ有增强。尽管M1系数没有组间差异，但PKMζ-EYFP重叠的M2测量在训练组小鼠的中分子层和外分子层ROI中显著增加。
CA3中PKMζ标记在训练组与未训练组相比，在str. pyramidale ROI和str. radiatum ROI中显著增加，但在str. lacunosum moleculare ROI中没有。虽然我们没有发现M1系数有任何组间差异，但这与str. pyramidale ROI和str. radiatum ROI的M2重叠系数增加相吻合，但在str. lacunosum moleculare ROI中没有。这与记忆标记CA3中来自DG而非内嗅皮层的突触输入持续增强一致。
CA1亚区中的PKMζ标记在训练组与未训练组相比，在str. pyramidale ROI和str. radiatum ROI中显著增加，但在str. lacunosum moleculare ROI中没有。与CA3类似，我们没有观察到M1系数的组间差异，但M2系数在str. pyramidale ROI和str. radiatum ROI增加，在str. lacunosum moleculare ROI没有。这一结果复制了先前的报告，并与长时程记忆训练导致Schaffer侧支-连合突触群体持续电生理增强一致。
在CA2内，我们没有发现任何ROI中PKMζ表达存在差异，也没有发现任何ROI中M1和M2系数存在差异。这与没有观察到训练相关的Arc激活证据一致。
PKMζ在记忆标记细胞中的整体海马变化模式是显著的。记忆训练一个月后，PKMζ的增加沿着海马回路的三突触通路追踪ROI，并且这种PKMζ痕迹对表达记忆相关EYFP的位点具有选择性。
2.1.2 激发实验2的结果
这些发现与（但未证明）以下假设一致：位置回避训练在与记忆相关的海马三突触“模型”通路中引起突触增强，但在与感觉信息处理相关的来自内嗅皮层的直接“数据”输入中没有。这种PKMζ记忆痕迹在表达已建立的位置回避记忆期间激活Arc的神经元中选择性观察到，而不仅仅是在学习期间，这与记忆训练增加CA1中的PKMζ并选择性地改变CA1 str. radiatum的突触功能以及最早在记忆训练30分钟后即可测量的上DG的观察结果一致。观察到的PKMζ组间差异预测，记忆更好的小鼠将在记忆标记细胞中表达更多的PKMζ。尽管只有四只训练组小鼠，但在PKMζ-EYFP共表达的M2系数与标记记忆的试验3中首次进入电击区的时间之间观察到大的皮尔逊相关性。校正两次计算（M1和M2）后，M2系数在上DG中内侧穿通路径终止的中分子层ROI处显著，这是Chung等人在自由行为小鼠中记录到长达60天的记忆诱导突触可塑性的位点；但在下DG的ROI处相关性不显著，这反映了电生理学观察结果。有强有力的证据表明，PKMζ蛋白表达在突触群体中持续且可检测地升高，特别是在ChR2-EYFP标记的神经元中，这些神经元是记忆相关细胞的富集样本。最后，先前的工作表明，训练诱导的PKMζ持续性增加和CA1 str. radiatum的突触增强，无论是否在训练一个月后测试记忆保留，两者都无法区分。
2.2 实验2 – 记忆的转录组谱分析
2.2.1 表征记忆相关行为
我们首先分析了野生型小鼠记忆训练组和yoked-对照组中的主动位置回避行为，作为研究与记忆相关的转录组谱的前提。在预训练期间，当电击关闭时，两组之间没有差异，正如预期。通过多种方式评估回避，包括进入电击区次数的减少、首次进入电击区时间的增加以及在电击区停留可能性的降低。正如预期，记忆训练的动物表现出强大的条件性回避，而yoked-对照组则没有，尽管相应的训练组和对照组小鼠经历了相同的物理条件。这些观察结果通过双向方差分析得到证实，具有显著的训练处理、试验及其交互作用效应。
冲突训练的动物表现出与标准训练组小鼠相似的快速回避学习。条件性位置回避的初始日间回忆在两个训练组之间也无法区分，并且正如预期，对照组不表达回避。当随后为冲突组重新安置电击区时，两个训练组的位置回避有所不同，特别是在重新安置电击位置的第一个试验中。冲突训练组在随后的试验中迅速学会避开重新安置的电击区，因此两个训练组之间避免电击的能力无法区分。类似地，两个yoked对照组之间的行为也无法区分。在条件试验后的第二天，在无电击的记忆保留测试中，当所有小鼠在相同条件下测试时，条件性回避持续存在且在两个训练组之间无法区分，在对照组中不表达。
空间记忆是一种复杂的现象，我们旨在将基因表达与之关联。为了识别不偏袒一种条件性回避估计的记忆分数，我们对自动行为分析位置跟踪获得的26个行为空间使用测量进行了主成分分析（PCA）。与电击回避和回避条件相关的测量被PC1捕获，我们将其解释为一个复合记忆指数，当分析从预训练到保留的所有数据时，它解释了37.4%的方差。遵循实验设计，我们将分析重点放在所有小鼠条件相同的保留期间的行为上，这也正好在安乐死之前。此时，PC1解释了52.4%的方差，PC2解释了14.9%的方差。对PC1负载最强的变量反映了回避行为，而PC2捕获了运动活动的测量。PC1显著区分了训练组和对照组小鼠，但PC2没有。我们将PC1指定为PC1mem ，并将其用作主动位置回避记忆行为表达的综合测量，PC2被指定为PC2act 。
2.2.2 空间记忆驱动海马亚区特异性的转录组变异模式
从DG、CA3和CA1海马亚区的训练和yoked四组小鼠样本中鉴定差异表达基因。由于RNA读数不足，共有5个样本被从分析中剔除。总共分析了39个样本。PCA区分了训练组和对照组的DG转录组，但没有区分CA3和CA1转录组。在任何亚区中，标准训练组和冲突训练组之间发现的显著DEGs都很少，因此我们将数据合并为一个训练组和一个对照组。在大约17,000个基因的转录组中，我们无法检测到训练组和对照组CA3样本之间的任何DEG，CA1样本中只有4个，而DG样本中鉴定出263个DEG，其中大多数是训练组相对于对照组增加的基因。我们还检验了编码LTP形成中涉及的分子的基因与记忆维持相关的假设，但在列出的249个基因中，只有7个在DEG列表中。DG、CA3和CA1中的总DEG列表可通过相关链接获取。
虽然Prkcz和相关转录本没有差异表达，但同时也是DEGs的IEGs与PC1mem 显著相关，并且它们的成对相关性为正。这些IEG关系在CA3中没有观察到，CA3只识别了记忆与编码PKC𝜄/λ的Prkci和编码AMPA受体亚基GluA2的Gria2基因之间的负皮尔逊相关性。Gria2也与AMPA受体亚基GluR1的基因Gria1和NMDA受体亚基GluN1的基因Grin1显著相关。此外，在CA3内，所有候选激酶的基因与靶向PKMζ到激活突触的KIBRA/WWC1基因Wwc1形成了一个共表达网络。在CA1中，虽然没有任何候选基因的表达与行为记忆线性相关，但显著成对相关性的模式介于DG和CA3模式之间，部分原因是Gria1表达与相互关联的IEGs共变，并且也与Prkcb和Wwc1（KIBRA）共变，而Wwc1本身与PKMζ基因Prkcz相关。
星形胶质细胞有助于突触功能和长时程记忆持久性，事实上，几个星形胶质细胞相关基因位于CA3 DEGs中，并且它们中的一些在CA3中的表达值与PC1mem 共变。虽然DG或CA1样本中的这些基因情况并非如此，但许多星形胶质细胞基因在DG、CA3和CA1的样本中相互关联。
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