引言
植原体（Phytoplasma）是一类隶属于Candidatus Phytoplasma属的专性寄生无细胞壁原核细菌，具有多形性，基因组较小，主要寄生于植物韧皮部和昆虫血淋巴。它们由叶蝉、飞虱等昆虫媒介传播，可侵染数千种植物，导致丛枝、黄化、小叶、花变叶等典型症状，是全球农林生产的重要威胁。分子诊断，特别是基于16S rRNA基因序列的分析，是植原体鉴定的主要方法，当16S rDNA序列无法区分时，常辅以核糖体蛋白基因（rp）、延伸因子Tu基因（tuf）、易位酶Y基因（secY）等管家基因进行分析。
广金钱草（Desmodium styracifolium），又名“Guang Jin qian cao”，是豆科（Leguminosae）山蚂蝗属的一种重要药用植物。此前仅有卵叶山蚂蝗（D. ovalifolium）和三花山蚂蝗（D. triflorum）被报道感染植原体。本研究旨在鉴定广东湛江地区首次发现的广金钱草小叶病的病原，以丰富对中国植原体分布和分子多样性的认识。
材料与方法
田间调查与样品采集
2024年9月，在广东省湛江市麻章区（21°15′8″ N, 110°6′11″ E）的田间观察到广金钱草植株表现出典型的小叶症状，其特征是叶片异常变小。调查了约300株植物，其中10株出现症状，发病率为3.33%。采集了4株病叶样本和1株健康叶样本用于分析。
DNA提取与分子鉴定
使用EasyPure Plant Genomic DNA Kit提取叶片总DNA。采用通用引物对P1/P7、R16mF2/R16mR1靶向16S-23S核糖体基因，以及特异性引物对secY-F/secY-R靶向secY基因进行PCR扩增。扩增程序为：94°C 10分钟，随后35个循环（94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 2分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，目标条带纯化后克隆至pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行Sanger法双向测序。
序列分析
对测序获得的16S rDNA和secY序列，通过NCBI的BLASTn程序进行初步比对。使用在线MUSCLE工具进行序列同源性分析。利用MEGA 6.0软件，采用邻接法构建16S rRNA基因和secY基因的系统发育进化树，自举检验1000次。通过在线工具iPhyClassifier对16S rRNA基因的F2nR2片段进行虚拟RFLP分析，以确定植原体的16S rRNA组和亚组。
结果
分子检测
使用植原体通用引物对P1/P7和R16mF2/mR1对所有样本进行PCR检测。在4个感病样本中均扩增出预期的约1.8 kb和约1.4 kb 16S rDNA片段，而健康样本中无扩增产物。使用引物对secY-F/secY-R对secY基因的扩增也得到了一致结果。这些结果证实了病原为植原体，并初步将其命名为广金钱草小叶植原体（DsLFP-GDZJ）。
16S rDNA序列分析
通过P1/P7引物对扩增获得了一段1806 bp的序列，包含16S rDNA、16S-23S rDNA基因间隔区（含tRNA基因）和部分23S rDNA序列。该序列在GenBank的登录号为PV546888。BLAST和MUSCLE分析显示，DsLFP-GDZJ的16S rDNA序列与花生丛枝（Peanut witches' broom）组（16SrII组）的植原体菌株同源性最高，尤其与“澳洲植原体”（‘Ca. Phytoplasma australasiaticum’，亚组16SrII-A和16SrII-D）菌株的序列同源性高达99.67%–100%。其中，与11个来自不同寄主植物的菌株序列完全一致（100%同源）。与16SrII-B、16SrII-C、16SrII-L等亚组菌株的同源性则在98.00%–98.56%之间。而与16SrVII、16SrV、16SrI等组的菌株相似性很低（89.25%–91.12%）。
系统发育分析进一步表明，DsLFP-GDZJ与16SrII组的25个菌株聚在一个主要分支内，其中与16SrII-A和16SrII-D亚组的菌株形成了紧密的进化小分支。
通过iPhyClassifier对DsLFP-GDZJ的16S rRNA基因F2nR2片段进行虚拟RFLP分析。结果显示，DsLFP-GDZJ的限制性酶切图谱与16SrII-A亚组的参考菌株L33765完全一致，相似系数为1.00，这进一步证明DsLFP-GDZJ属于16SrII-A亚组。
secY基因序列分析
通过secY-F/secY-R引物对扩增获得了一段1425 bp的序列，包含完整的secY基因编码区。该序列在GenBank的登录号为PV553464。BLAST分析表明，DsLFP-GDZJ的secY序列与多个属于16SrII组的植原体菌株（包括4个“澳洲植原体”菌株）的secY序列具有100%的一致性。基于secY基因序列构建的系统发育树显示，DsLFP-GDZJ与来自16SrII-A亚组的7个菌株和1个来自16SrII-D亚组的菌株聚在一起，进一步支持了16S rDNA分析的结果。
讨论
植原体病害是全球范围内最具破坏性的植物病害之一。在中国，已有超过100种植物被报道感染植原体。本研究发现，2024年在广东湛江田间首次出现的广金钱草小叶病，其病原被确定为“澳洲植原体”的一个新菌株，命名为DsLFP-GDZJ，隶属于16SrII-A亚组。这项研究是“澳洲植原体”在广金钱草上引起病害的首次报道，从而确立了广金钱草作为一种新的植原体寄主植物。
在中国，植原体遗传多样性丰富，已报道有12个不同的组别。广东省地处中国南部的热带和亚热带地区，植原体病害发生严重，迄今已报道存在至少4个组（16SrI, 16SrII, 16SrV, 16SrVI）。其中，16SrII组植原体是影响茄科、豆科和葫芦科植物的优势类群。本研究揭示了广金钱草是16SrII-A亚组植原体的新寄主。为制定有效的媒介防控和病害控制策略，后续需要进一步研究植原体的多种传播途径，以阻断其传播链。
结论
本研究发现广东省湛江市田间广金钱草发生了一种新的植原体病害，表现为典型的小叶症状。通过分子生物学方法，鉴定出其病原为一种新的植原体菌株，命名为DsLFP-GDZJ。基于16S rRNA和secY基因的序列相似性分析、系统发育分析，以及对16S rRNA基因的虚拟RFLP分析结果，证实DsLFP-GDZJ是“Candidatus Phytoplasma australasiaticum”的一个菌株，属于16SrII-A亚组。本研究是“澳洲植原体”（16SrII-A组）引起广金钱草小叶病在中国的首次报道，从而确定了广金钱草是植原体的新寄主植物，为理解中国植原体的分布、宿主范围和分子多样性提供了新的信息。
