肾脏驻留多瘤病毒的命运分异：稳定脱落与近乎沉默的持续性
1. 引言
多瘤病毒(PyVs)是研究最为深入的肿瘤病毒之一，可作为研究病毒致癌、DNA复制和宿主-病毒相互作用的经典模型系统。50-90%的成人对其血清学呈阳性，反映了广泛的终生暴露。然而，一个基本问题仍然悬而未决：这些基因组仅约5kb的简单DNA病毒，如何在宿主体内持续存在数十年？这具有重要的临床后果，因为多瘤病毒的持续感染和再活化是免疫低下状态下严重疾病的基础，例如肾移植后的BK多瘤病毒(BKPyV)相关性肾病和移植物衰竭，以及JC多瘤病毒(JCPyV)驱动的进行性多灶性白质脑病。尿路脱落是肾嗜性多瘤病毒的一个标志性特征，也是持续感染期间病毒复制活动的临床相关无创读数。在人类中，BKPyV和JCPyV优先在肾脏持续存在并脱落至尿液中，纵向研究显示其特征通常是偶发的高水平脱落，其间夹杂着最低或无法检测到病毒输出的时期。鼠多瘤病毒(muPyV)系统能够重现肾嗜性、长期持续性和尿路脱落，为在可控的实验环境中探究这些脱落模式背后的机制提供了一个强大的体内模型。
随着下一代测序技术的发展，研究人员构建了一个遗传条形码标记的muPyV文库，该文库能保持病毒适应性，并能在体内纵向、无创地同时追踪数千个不同的病毒谱系。先前的研究发现了持续感染期间至少两种不同的尿路脱落模式：一种涉及最初数千、随后数百个病毒条形码的持续、低水平脱落（“阴燃”），以及在持续感染后期由一个或少数几个条形码主导的偶发性高水平脱落事件。然而，一些基本问题仍未得到解答：在长期感染期间，哪些持续存在于肾脏的病毒基因组最终导致了尿路脱落？大多数肾脏驻留的病毒基因组是否都贡献于尿液病毒载量，还是许多基因组持续存在却不脱落？在那些确实脱落的病毒中，长期的持续性脱落是由一个稳定的肾脏驻留病毒谱系子集驱动的，还是由不同病毒基因组随时间的瞬时贡献所驱动？肾脏病毒丰度是否能预测长期的脱落命运？这些悬而未决的问题构成了本研究的基础。
目前对PyV脱落模式的理解呈现出与潜在潜伏和再激活一致的特征。近期关于BKPyV的研究模型从病毒驱动的细胞周期控制转向宿主门控模型，即进入S期是强大大T抗原(LTAg)表达所必需的，早期转录受到非编码控制区(NCCR)对包括RB-E2F轴在内的宿主转录因子的响应所塑造。宿主免疫信号与细胞周期门控并行作用，共同塑造持续感染。BKPyV感染在内皮细胞中诱导强烈的IRF3驱动的干扰素反应，但在肾上皮细胞中则不，这为病毒在肾脏中长期持续存在创造了一个允许的细胞环境。单细胞转录组研究强化了这一观点，揭示了由S/G2M细胞周期程序、DNA损伤和复制应激通路、MAPK激活、线粒体应激以及干扰素刺激和抗原呈递基因抑制所表征的产毒性感染的一致宿主特征。重要的是，只有少数被感染细胞成为具有强大晚期衣壳转录的高生产者，而大多数尽管有相似的病毒暴露，仍保持低度或受限的转录状态。这些观察结果促使研究人员提出假说：一个病毒谱系库子集倾向于持续/频繁脱落，而其他病毒基因组则以深度受限的状态在肾脏中持续存在，很少再激活以贡献于尿液病毒组。
2. 材料与方法
本研究采用了先前发表的遗传条形码muPyV(PTA株)文库，每个病毒基因组在一个中性位置插入一个独特的12核苷酸随机条形码。实验工作流程概述包括用条形码muPyV文库感染、纵向尿液收集、终点器官采集、DNA提取和基于NGS的条形码定量分析
所有动物程序均经批准。用条形码muPyV文库单次腹腔注射感染两只雌性和两只雄性健康的FVB/NJ小鼠。在整个感染过程中多次（每周两到三次）无创收集尿液样本，用于下游条形码测序和病毒载量定量。在研究终点（小鼠MR为感染后59天，其余三只小鼠为感染后99天），采集一系列器官以捕获病毒条形码的完整组织分布。
从尿液、组织和血液中纯化DNA，并通过实时定量PCR(qPCR)量化每个样本的总病毒基因组丰度。通过靶向扩增含条形码区域后进行Illumina测序来确定条形码身份和相对丰度。从FASTQ文件中提取条形码序列，并使用Starcode消息传递聚类定义输入条形码的参考集，将下游分析限制在占病毒库前99%累积丰度的条形码子集，排除了低复杂性的人工序列，得到了约4012个独特条形码的参考集。
为了量化尿液和组织样本中的条形码丰度，将每个观察到的样本条形码根据编辑距离映射到最接近的库条形码。丢弃与任何库条形码距离大于3的样本条形码。为了减少极低丰度信号的影响，移除了加权条形码计数低于10的结果，这作为后续条形码水平分析的检测阈值。
由于生物样本间的总病毒基因组丰度不同，条形码计数被独立地基于qPCR测量的病毒载量（近似为检测到的病毒基因组量）进行归一化。对于每个样本，首先计算每个库条形码贡献的总条形码信号（定义为条形码分配后的加权条形码计数）的比例，然后将此比例乘以该样本中测得的病毒基因组浓度，以获得估计的条形码特异性病毒载量。这个缩放后的量被称为“条形码水平”，代表在考虑了样本内的相对代表性和该样本的绝对病毒基因组载量后，单个病毒条形码的估计丰度。
对于每只动物，将晚期窗口定义为处死前的最后两个尿液收集时间点。如果在此窗口任一时间点在尿液中检测到，则将肾脏条形码分类为“晚期脱落”；如果在此窗口未检测到，则分类为“晚期非脱落”。从组织测序数据中识别出在肾脏样本中检测到的条形码，将其定义为肾脏驻留条形码。
3. 结果
3.1. 晚期尿路脱落源于少数肾脏条形码，揭示巨大的非脱落病毒库
为了确定肾脏驻留病毒条形码如何贡献于晚期尿路输出，研究人员基于条形码在感染最后阶段的检测情况对其进行分类。结果发现，在所有四只小鼠中，晚期非脱落条形码的数量都大大超过了晚期脱落条形码。例如，在FL小鼠中，识别出1305个晚期非脱落肾脏条形码，而晚期脱落条形码为188个。这表明，在每只小鼠中，晚期尿路脱落仅源于肾脏条形码多样性的少数，意味着大多数持续存在于肾脏的病毒基因组在晚期对尿液的检测没有贡献。
接下来，研究人员询问晚期非脱落条形码是代表稀有的肾脏驻留者，还是在肾脏内形成了病毒基因组的主要定量储存库。对每只小鼠分别汇总晚期脱落和晚期非脱落条形码组的肾脏条形码水平（表达为每微克肾脏DNA的qPCR缩放病毒基因组丰度）。在四只小鼠中的三只（FL、ML和MR）中，晚期非脱落条形码贡献了总肾脏病毒基因组丰度的大部分。即使在总肾脏条形码水平更高的FR小鼠中，晚期脱落条形码所包含的独特肾脏条形码数量仍少于晚期非脱落条形码，这表明从晚期尿液中缺失并不仅仅是肾脏低丰度的结果。
研究人员进一步检验了肾脏条形码丰度本身是否能预测晚期尿路脱落。比较了每只小鼠内晚期脱落和晚期非脱落组之间每个条形码的肾脏丰度值。在所有动物中，观察到了宽动态范围和组间显著的丰度重叠。虽然一些高丰度的肾脏条形码是晚期脱落的，但许多具有相当肾脏水平的条形码仍然是晚期非脱落的。因此，仅凭肾脏条形码丰度不足以解释病毒基因组是否会贡献于晚期尿路脱落。
3.2. 晚期脱落而非晚期非脱落的肾脏条形码对持续性尿路脱落有实质性贡献
先前的研究表明，尽管许多病毒基因组在尿液中可检测到，但长期持续性感染期间的脱落主要由一小部分条形码主导。本研究检验了这一原则在将肾脏驻留病毒基因组按晚期脱落行为分层后是否依然成立。研究人员检查了被分类为晚期脱落或晚期非脱落的肾脏条形码的纵向尿液脱落模式，重点关注每组中最丰富的肾脏条形码（每只小鼠前50名）。对于每个尿液样本，计算了每个条形码的相对丰度（定义为该条形码特异性加权计数占该尿液样本内总条形码衍生丰度的比例），并使用环形图可视化这些相对组成。同时，通过汇总条形码水平来量化对尿液脱落的绝对贡献，并使用叠加图随时间可视化这些值。
观察发现，感染持续期（感染后第27天之后）的尿液脱落越来越多地反映了所有四只小鼠中少数晚期脱落肾脏条形码的贡献。这些条形码在环形图中显示为对应于前50个最丰富条形码的彩色片段。相比之下，晚期非脱落肾脏条形码的环形图显示，在晚期时间点，彩色条形码几乎没有或完全没有贡献，反映了它们在尿液中的比例持续较低。因此，虽然许多条形码仍然可检测到，但只有晚期脱落的肾脏条形码在整个持续感染过程中在尿液条形码群体中达到高比例丰度。
通过叠加分析发现，在所有四只小鼠中，在感染的持续期，晚期脱落肾脏条形码对总尿液条形码水平的贡献份额远大于晚期非脱落的肾脏条形码。晚期非脱落的肾脏条形码对随时间累积的尿液脱落的贡献微乎其微，即使它们在肾脏中含量丰富，这表明仅肾脏驻留并不能预测对持续性尿路脱落的贡献。
3.3. 晚期脱落条形码在整个持续感染过程中呈现纵向一致性
晚期脱落肾脏条形码在群体水平上的主导地位引出了一个疑问：这种模式是否反映了个体病毒谱系一致的纵向行为，还是持续感染后期的瞬时效应。为了解决这个问题，研究人员在每条形码分辨率上分析了肾脏晚期脱落条形码、肾脏晚期非脱落条形码以及一个数量匹配的随机条形码对照组的尿液脱落轨迹。观察发现，在所有四只小鼠中，个体晚期脱落肾脏条形码在多个尿液时间点上重复检测到，超过了条形码水平的检测阈值。许多条形码形成了跨越连续或非连续尿液样本的延伸脱落轨迹，而非孤立的检测事件。这种持续的活动在所有动物中都是一致的，表明晚期脱落反映的是稳定的、条形码特异性的纵向行为，而非由单一瞬态峰值驱动的主导。
相比之下，晚期非脱落肾脏条形码和随机选择的条形码对照很少在尿液中被检测到。当晚期非脱落条形码被检测到时，尿液条形码水平通常较低，并且仅限于孤立的时间点。虽然偶尔有晚期非脱落条形码达到较高的尿液条形码水平，但这些事件是零星且非重复性的，在随后的尿液收集中未能持续。晚期非脱落条形码的纵向模式与随机对照非常相似，表明持续性尿液脱落特异性富集于晚期脱落肾脏条形码，而非条形码取样或肾脏驻留的一般性结果。
3.4. 晚期脱落与晚期非脱落肾脏条形码的分化并非由输入丰度差异所致
稳定的、条形码解析的尿液脱落差异引发了另一种可能性，即晚期脱落和晚期非脱落行为可能反映了在病毒接种物中已存在的差异。研究人员通过检查在输入病毒库中，前50个肾脏晚期脱落和前50个晚期非脱落条形码的相对丰度来检验这一点。将条形码按接种物中的丰度排名，并比较了所有四只小鼠中肾脏晚期脱落和晚期非脱落条形码的库排名分布。
结果发现，肾脏晚期脱落和晚期非脱落条形码在输入库排名中跨越了广泛且重叠的范围。在所有四只小鼠中，两组的输入排名中位数都落在接种物的前25%内，表明在感染时，没有任何一组被优先过度代表。缺乏系统的库排名差异表明，晚期脱落行为是在感染过程中出现的，而不是由输入丰度预先决定的。如果晚期脱落条形码仅仅因为较高的输入丰度而被优先选择，那么预计它们在病毒库中的排名会持续高得多。相反，肾脏晚期脱落和晚期非脱落条形码以相当的输入丰度特征进入感染，这支持了一个模型，即早期的宿主-病毒相互作用确立了不同的长期脱落轨迹。
3.5. 晚期脱落肾脏条形码达到比晚期非脱落和随机条形码对照组更高的尿液峰值水平
持续的纵向脱落可能源于重复的低水平活动，也可能源于偶尔的高振幅脱落事件。研究人员通过比较每个条形码达到的最大单时间点尿液丰度来区分这两种可能性。对于每只小鼠，测量了前50个晚期脱落肾脏条形码、前50个晚期非脱落肾脏条形码和50个随机选择的尿液条形码对照在所有时间点观察到的最高尿液条形码水平，并跨组比较了这些值。
研究发现，在所有四只小鼠中，晚期脱落肾脏条形码始终达到比晚期非脱落肾脏条形码和随机尿液条形码对照组更高的尿液峰值水平。晚期脱落肾脏条形码的分布在对数尺度上向上偏移，表明在感染过程中至少一次达到高振幅尿液检测的倾向性更大。相比之下，晚期非脱落肾脏条形码即使考虑其单次最大检测事件，也很少达到较高的尿液水平。随机尿液条形码对照显示出类似的分布，偶尔有低水平的峰值，但几乎没有高振幅脱落的证据。这些结果表明，高振幅尿液脱落是晚期脱落病毒的一个选择性特征，而非在尿液中检测到的一般性结果。
3.6. 顶级阴燃条形码在晚期脱落条形码中选择性富集
持续的、反复的尿液检测（“阴燃”）可能反映随机的条形码出现，也可能反映与晚期脱落相关的病毒谱系的优先活动。研究人员根据跨尿液时间点的检测频率来操作性定义阴燃。对于每只小鼠和每个条形码，计算了该条形码在尿液时间点中被检测到超过条形码水平检测阈值的比例。使用此指标，将每只小鼠中检测频率最高的前50个条形码定义为“顶级阴燃条形码”，并测试这些条形码是否在晚期脱落或晚期非脱落肾脏条形码中富集，与一个大小匹配的随机尿液条形码基线进行比较。
在所有四只小鼠中，研究发现顶级阴燃条形码中属于晚期脱落组的比例远大于属于随机尿液对照组。相比之下，相对于随机对照，在晚期非脱落组中几乎没有观察到顶级阴燃条形码的富集。这表明阴燃行为并非随机分布在病毒条形码中，而是选择性地富集在最终贡献于晚期尿路脱落的肾脏条形码中。
3.7. 晚期脱落条形码在感染早期已表现出更高的阴燃活性
前述分析测试了跨尿液时间点频繁检测（“阴燃”）的条形码是否在晚期脱落肾脏条形码中富集，但并未解决这种行为是否在感染后早期就已显现。为了区分早期确立与晚期出现的脱落行为，研究人员接下来询问了最终主导晚期尿液的条形码是否在感染早期阶段就已表现出更高的检测率。将每只小鼠的尿液时间进程按天数划分为早期阶段和晚期阶段，晚期阶段定义为最接近处死时间的最后四分之一的尿液采样时间点，早期阶段定义为在此之前的所有时间点。
对于每只小鼠，量化了三组条形码的早期阴燃情况：在晚期阶段检测频率排名前50的晚期阴燃条形码；在晚期阶段尿液条形码水平总量排名前50的晚期高脱落条形码；以及一个大小匹配的随机尿液条形码对照组。对于每个条形码，计算了其在早期阶段天数中被检测到超过检测阈值的比例。
研究发现，在所有四只小鼠中，无论是晚期阴燃还是晚期高脱落条形码，其早期检测频率都显著高于随机尿液条形码。这些结果表明，无论是通过跨尿液时间点的持续检测，还是通过尿液中的高累积条形码水平来定义，最终主导晚期尿液的病毒条形码在感染早期就已经在尿液中不成比例地被检测到。因此，通过多种标准，可以得出结论：尿路脱落命运在感染早期即已确立。
3.8. 晚期非脱落肾脏条形码群体与血液或其他组织关联微弱
先前的研究表明，同一小鼠内不同器官间的条形码相对丰度相关性较差，表明产毒性病毒群体在很大程度上是组织局部的，而非自由交换的。在本研究中，研究人员询问这一原则是否适用于功能不同的肾脏条形码群体。为此，研究人员将晚期脱落和晚期非脱落肾脏条形码视为两个伪器官区室，并检查了在每个小鼠内，这些肾脏定义的组与其他组织之间条形码相对丰度的相关性。
在所有四只小鼠中，研究人员观察到晚期脱落和晚期非脱落肾脏组的条形码相对丰度与非肾脏组织间的相关性都很弱。尽管一些在一个组织中高水平检测到的条形码在其他地方也可检测到，但最丰富条形码的身份在不同区室间是不同的，这表明肾脏驻留的病毒基因组分离成功能不同的群体，其丰度模式在很大程度上与其他组织脱钩。
在可获得全血样本的三只小鼠（FL、FR和ML）中，研究人员发现血液条形码丰度与晚期非脱落肾脏条形码之间几乎没有相关性，这反驳了沉默的肾脏病毒库持续受到血源性播种的观点。晚期脱落和晚期非脱落肾脏群体内的条形码相对丰度在动物之间也显示出低相关性，表明肾脏条形码的命运是在每个宿主体内独立确立的。
3.9. 脱落与非脱落命运的出现与条形码序列组成无关
晚期脱落行为的差异可能源于条形码序列本身的固有特征。研究人员通过检查多个序列特征来验证这种可能性，包括GC含量、条形码长度以及预测的宿主和病毒miRNA种子匹配。
对于GC含量和条形码长度，分析了每只小鼠前50个肾脏晚期脱落和前50个肾脏晚期非脱落条形码。在所有小鼠中，晚期脱落和晚期非脱落条形码的GC含量分布与全局条形码分布密切重叠，表明没有异常高或低GC含量的富集。条形码长度分布在所有四只小鼠的晚期脱落和晚期非脱落条形码之间也几乎相同，没有特定条形码长度的富集。
由于设计的条形码被整合到早期和晚期mRNA中以标记单个附加体，研究人员确定了宿主或病毒miRNA是否可能是造成晚期脱落和晚期非脱落肾脏病毒群体不同的原因。为了确定miRNA介导的靶向是否会偏向脱落命运，研究人员检查了预测的宿主小鼠miRNA和muPyV编码的miRNA在分类为晚期脱落或晚期非脱落的肾脏驻留条形码中的种子匹配。具体来说，miRNA种子匹配被定义为与成熟miRNA 5‘端第2-8个核苷酸完全沃森-克里克互补。对于宿主肾脏高丰度前100名的miRNA，量化了包含至少一个预测miRNA种子匹配的肾脏条形码比例，以及归因于miRNA靶向条形码的总肾脏病毒丰度比例，并在每只小鼠的基础上比较了晚期脱落和晚期非脱落组的这些值。在所有四只小鼠中，宿主miRNA靶向的非加权和丰度加权度量在晚期脱落和晚期非脱落条形码群体之间高度相似，并且落在通过长度和GC匹配重采样对照生成的零分布内，表明除了条形码序列组
