在大肠杆菌中重组BhrPETase的高产生产及稳定性提升

时间：2026年3月16日

来源：International Journal of Biological Macromolecules

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本研究通过优化重组Bhr6M在3升生物反应器中的发酵条件（30℃、0.3g·L⁻¹·h⁻¹乳糖），并采用AlphaFold3、PROSS算法及组合突变体设计，获得双突变体Bhr-S184H/M57I。该突变体产率达3.17g·L⁻¹，半衰期在70℃下延长66倍，30℃下30天活性保留超90%，且降解amor phous PET速度提升2倍。分子动力学模拟揭示其稳定性源于新的氢键网络及关键区域构象刚性增强。为工业级PET生物降解奠定基础。

李林辉|魏梦生|曹家仁|李玉秋|陶伟|冯文宁|刘波|苏玲巧

江南大学生物技术学院及工业生物技术教育部重点实验室，中国无锡市蠡湖大道1800号，214122

摘要

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）污染是一个全球性的环境问题，而酶促降解是一种有前景的环保解决方案。BhrPETase突变体Bhr6M表现出较高的降解效率，显示出在PET生物降解方面的巨大潜力。为了促进其实际应用，我们通过3升生物反应器在大肠杆菌（Escherichia coli）中扩大了重组Bhr6M的生产规模，并确定了最佳诱导条件：温度为30°C，乳糖添加量为0.3克/升·小时（0.3 g·L⁻¹·h⁻¹）。然而，该酶溶液的稳定性有限，在30°C下的半衰期（t_1/2）约为4天，在70°C下为4小时，这限制了其更广泛的应用。为了解决这一问题，我们利用AlphaFold3、PROSS和组合突变技术设计出了双突变体Bhr-S184H/M57I，其性能得到了协同提升。该突变体在大约31小时的发酵过程中产出了3.17克/升（3.17 g·L⁻¹）的酶，这是迄今为止报道的PET水解酶中最高的产量。其稳定性得到了显著提高，在70°C下的半衰期比Bhr6M长66倍，在30°C下30天后仍保留了超过90%的活性。此外，该突变体在70°C下48小时内可降解97%的无定形PET，而Bhr6M在其最佳温度60°C下则需要96小时才能完成相同程度的降解。随后，我们通过处理过的PET瓶子的降解实验进一步验证了其实际应用价值，降解率超过了95%。分子动力学（MD）模拟表明，其稳定性的提高源于关键区域新的氢键网络和构象灵活性的降低。本研究提供了一种可扩展的策略，能够同时提高酶的产量和稳定性，为工业PET生物降解奠定了基础。

引言

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种性能优异的合成聚合物，自20世纪中叶以来被广泛应用于包装材料、纺织纤维、饮料瓶和医疗设备中。全球每年PET的产量已超过7000万吨[1]。然而，PET极高的化学稳定性使其在自然环境中难以降解。PET废物的大量积累导致了“白色污染”，不仅破坏了生态环境，还通过微塑料和纳米塑料进入食物链，对生态系统和人类健康构成威胁[2]。因此，高效且环保的PET废物处理方法已成为一个紧迫的全球性环境与资源问题。

目前PET废物处理技术主要包括物理、化学和生物方法。其中，生物方法利用PET水解酶催化PET的水解反应，具有反应条件温和、底物特异性高和环保等优点[3]，因此被认为是最具前景的方法。近年来，在PET水解酶的基因鉴定和分子改造方面取得了显著进展，这些努力带来了一系列突破性成果。值得注意的酶包括叶枝角质酶（LCC）及其变体ICCG[4]、Ideonella sakaiensis的PETase（IsPETase）及其变体FAST-PETase和HotPETase[5],[6]、Kibdelosporangium aridum的热稳定KaPETase[8]以及Saccharomonospora viridis衍生的热稳定聚酯酶[9]。我们的团队也在此领域进行了研究，并开发出了突变体BhrPETase^SGICCK（以下简称Bhr6M）。与野生型BhrPETase（来自HR29菌的PETase）相比，Bhr6M对无定形PET粉末的降解效率提高了3.2倍，在96小时内可降解97%[10]。足够的PET水解酶产量有助于其大规模应用[11]，但目前对其催化效率的工程改造关注度相对较低。目前，PET水解酶已在大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、毕赤酵母（Pichia pastoris）等微生物中表达，其中大肠杆菌因其遗传特性明确、易于培养和基因操作、生长迅速、成本低以及成熟的发酵工艺而成为最常用的平台[12]。例如，LCC和IsPETase已在大肠杆菌中表达，但其产量均低于1克/升（1 g·L⁻¹[13],[14]。4Mz（来自Thermobifida fusca的角质酶的变体）的表达规模得到了扩大，在3升生物反应器中的产量达到了555.40单位/毫升（555.40 U·mL⁻¹[15]。此外，一些PET水解酶也在枯草芽孢杆菌和毕赤酵母中表达[16]；当使用毕赤酵母作为宿主时，FAST-PETase在30升发酵罐中的产量达到了3.23克/升[17]。酶溶液的稳定性也是实际应用中的重要因素，储存和运输过程中的稳定性差会大幅增加生产成本并降低工艺经济效益[18]。酶的热稳定性是其工业应用价值的核心指标——更高的热稳定性不仅延长了酶的使用寿命，还能使其在较高温度下保持较高的酶产量，从而提高反应速率和底物转化率[19],[20]。大量研究表明，定点突变（一种核心的分子改造策略）可以显著提高酶的热稳定性[21]。例如，Klebsiella aerogenes的酯酶EstKa经过定点突变后，在45°C下的稳定性得到提高[22]；PET水解酶IsPETase的双突变（W159H/F229Y）提高了其熔点[23]；韩国团队对一种新型PET水解酶进行合理工程改造后，其热稳定性和水解活性均得到了增强[24]。

在本研究中，我们使用了之前开发的PET水解酶Bhr6M，在大肠杆菌中实现了大规模生产，并进一步提升了其稳定性。在已知的PET水解酶中，Bhr6M因其高降解效率和良好的耐热性而脱颖而出，但仍无法满足工业应用的严格要求。在对工程菌株进行3升生物反应器发酵并评估其较差的储存稳定性后，我们通过定点突变技术提高了其稳定性，同时保持了酶的产量，最终实现了预期的稳定性提升和PET降解性能的增强。这项工作为Bhr6M的可扩展生产和稳定性工程提供了实用策略，为其在PET生物降解中的工业应用奠定了基础。

材料

本研究使用大肠杆菌JM109进行突变质粒的克隆和构建，而大肠杆菌BL21 Star(DE3)作为重组蛋白表达的宿主。两种菌株均使用了携带C端6个组氨酸标签（6 × Histidine tag）的pET-24a(+)质粒作为表达载体。Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购自中国南京的Vazyme Biotech有限公司。pEASY®-Basic无缝克隆和组装试剂盒则来自北京的TransGen Biotech公司。

重组菌株的构建及Bhr6M的表达

储存在实验室-20°C条件下的重组质粒pET24a(+)-Bhr6M，通过化学转化方法转入大肠杆菌BL21 Star(DE3)感受态细胞中。转化产物在含有卡那霉素的平板上筛选，并通过菌落PCR进行验证。阳性克隆被接种到LB培养基中，在37°C下培养10–12小时后，转移到TB培养基中进行诱导表达。24小时后的酶活性达到最大值44.3单位/毫升（44.3 U·mL⁻¹）。

结论

PET污染是一个全球性的环境问题，酶促降解是一种有前景的环保解决方案。我们团队之前开发的PET水解酶突变体Bhr6M具有较高的降解效率，在PET生物降解方面具有巨大潜力。我们成功在3升生物反应器中扩大了其生产规模，最佳诱导条件为温度30°C，乳糖添加量为0.3克/升·小时（0.3 g·L⁻¹·h⁻¹）。为了解决Bhr6M稳定性不足的问题，我们采用了PROSS算法进行合理设计

CRediT作者贡献声明

李林辉：撰写原文、方法学设计、数据整理。魏梦生：软件开发、方法学设计、概念构思。曹家仁：软件开发、方法学设计、实验研究。李玉秋：方法学设计、实验研究、数据分析。陶伟：软件开发、实验研究、数据分析。冯文宁：软件开发、项目管理、数据整理。刘波：资源协调、项目管理。苏玲巧：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源协调、数据整理、概念构思。