通过QS分子优化绿藻与HN-AD细菌的共生系统，以用于沼气浆液的处理

优化异养硝化反硝化（HN-AD）细菌与微藻共生系统，通过调整气升速率（0.6 L·min⁻¹）和引入链长梯度群体感应分子（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL），发现C8-HSL显著提升氮磷及COD去除效率，达9.09%-14.25%，并增强Corynebacterium丰度，上调nirK、nifDHK等关键基因表达，验证PICRUSt2预测可靠性。

张倩|魏福|秦书敏|聂碧香|邓琳|陈铮|华思宇

重庆理工大学化学与化学工程学院，中国重庆400054

摘要

异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）细菌与小球藻的共生系统存在多个局限性，包括高能耗、共生关系弱以及污染物去除效率低。为了解决这些问题，本研究优化了曝气速率。此外，基于信号分子的结构链长度梯度，引入了三种群体感应（QS）分子，即C4-HSL、C6-HSL和C8-HSL。该方法旨在评估它们对系统宏观性能的影响，并探讨其增强机制。结果表明，在最佳曝气速率0.6 L·min⁻¹下，C8-HSL显著提高了污染物去除效率，NH₄⁺-N、TN、TP和COD的平均去除率分别提高了9.09%、10.81%、13.78%和14.25%。高通量测序显示，C8-HSL显著富集了棒状杆菌（48.72%），增强了细菌-藻类共生关系，并改善了氮和磷的去除效果。PICRUSt2功能预测表明，C8-HSL通过上调参与反硝化和固氮的关键基因（nirK和nifDHK）增强了氮代谢通量，同时显著增加了与磷代谢相关的pat基因的丰度。qPCR分析进一步证实了nirK和nifDHK的表达上调，验证了PICRUSt2预测的可靠性。这些发现表明，C8-HSL有效提升了HN-AD细菌-小球藻共生系统的性能，并为QS分子的工程应用提供了理论基础。

引言

未经处理的畜禽沼气污泥直接排放会带来严重的环境风险，加速水体富营养化，威胁公共卫生并加剧温室效应[1]、[2]、[3]。虽然传统的生物处理方法（如活性污泥工艺）具有成本效益，但其氮和磷去除效率受到沼气污泥高浓度污染物的严重限制[4]。为了解决这一问题，广泛研究了活性污泥-微藻共生系统，利用“产氧-固碳”循环。目前，大多数报道的细菌-藻类共生系统依赖于将微藻与传统的活性污泥结合。然而，传统污泥中的微生物组成非常复杂且难以预测，导致处理效率波动。此外，活性污泥中的传统硝化菌和反硝化菌生长缓慢，对高浓度氨氮非常敏感，并且需要严格分离的好氧和厌氧环境——这与微藻创造的高氧环境存在根本冲突[5]、[6]。为了克服传统系统的局限性，我们的研究团队首次开发了一种新型的高效共生系统，该系统由小球藻和一种特定定义的异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）细菌菌株组成（专利菌株，专利号ZL201811475870.9）。与复杂的微生物联合体不同，这种特定的HN-AD细菌可以在单一的好氧环境中同时进行碳、氮和磷的去除，对高浓度氨具有极强的耐受性，并完美补充了小球藻提供的富氧环境。在初步研究中，我们成功确定了该新型系统的最佳细菌与藻类体积比[7]。

尽管已经确定了HN-AD细菌-小球藻共生系统的物理参数，但仅优化宏观物理比例不足以解决内在的操作挑战。通常，高浓度废水需要过度曝气以刺激细菌活性[8]。然而，剧烈曝气会导致高能耗[9]，加速CO₂释放[10]，并产生过量的溶解氧，抑制藻类光合作用[11]，从而破坏共生关系。从物理曝气转向生物调控，群体感应（QS）代表了一种信号分子介导的细胞间通信机制，为加强种间相互作用提供了有希望的方法[12]、[13]、[14]。先前的研究已经验证，外源信号分子（如N-酰基同型丝氨酸内酯，AHLs）可以增强传统系统中的微生物通信和污染物降解[15]、[16]、[17]、[18]。然而，关于使用信号分子增强HN-AD细菌-小球藻共生系统的研究还有限。尽管我们的初步研究已经确定了该新型共生系统的最佳细菌与藻类体积比，但信号分子增强的潜在机制仍需进一步研究。因此，探索各种外源信号分子对该特定系统的影响是一个关键的科学空白。解决这一空白可以为高效调节细菌-藻类共生关系提供新的见解，从而实现高浓度沼气污泥废水的先进生物处理。

因此，本研究旨在系统地研究信号分子类型对HN-AD细菌-小球藻共生系统的影响，从而填补这一知识空白。具体来说，选择了C4-HSL（短链）、C6-HSL和C8-HSL（中链），因为它们代表了调节革兰氏阴性细菌EPS产生和生物膜表型的关键AHL信号结构梯度。使用摇瓶实验系统研究了：1）不同曝气速率对HN-AD细菌-小球藻共生系统中污染物去除效率的影响；2）不同类型的外源QS信号分子对处理性能的影响；3）通过高通量测序和多样性分析，在最佳曝气和QS条件下的微生物群落结构变化；4）通过PICRUSt2功能预测阐明优化系统中参与氮代谢的关键功能基因和酶；5）通过定量实时PCR（qPCR）验证这些预测的准确性。

实验装置

本实验使用了一种结合了磁力搅拌器和水浴系统的装置，反应容器为500 ml锥形烧瓶，实际液体体积保持在300 ml。实验装置的示意图如图1所示。旋转速度设置为300 ± 50 rpm，温度控制在28–30 ℃范围内，以确保最佳的搅拌和热条件。使用5 W白色LED灯作为光源，配置为连续运行

曝气对HN-AD细菌-小球藻共生系统中污染物去除效率的影响

图2展示了三种信号分子（C4-HSL、C6-HSL和C8-HSL）在六种曝气速率（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 L·min⁻¹）下对HN-AD细菌-小球藻共生系统污染物去除效果的增强作用。添加小球藻不仅提高了氨氮的去除效率，还显著增强了磷的去除效率。根据先前的研究，过量的溶解氧通过抑制光合作用和叶绿素生产来抑制藻类生长

结论

本研究表明，精确的曝气调节结合QS调控是提升HN-AD细菌-小球藻共生系统性能的有效策略。曝气速率为0.6 L·min⁻¹并结合C8-HSL被确定为最佳操作条件，在此条件下，共生系统实现了氮、磷和有机物的强效去除。C8-HSL通过选择性富集

CRediT作者贡献声明

张倩：撰写 – 审稿与编辑，资金获取，概念构思。魏福：撰写 – 原始草稿，数据整理。秦书敏：撰写 – 原始草稿，数据整理。聂碧香：验证，正式分析。邓琳：验证，数据整理。陈铮：验证，监督。华思宇：监督，正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作最终得到了自然科学基金（CSTB2023NSCQ-MSX0412）、重庆市教育委员会科学技术研究计划（KJQN202401111）、重庆理工大学研究生教育高质量发展项目（gzlcx20243247）以及重庆理工大学研究创新团队培养计划（2023TDZ009）的支持。