黄曲霉毒素，特别是黄曲霉毒素B1（AFB1），是毒性最强的霉菌毒素之一，由于其致癌、致突变和致畸特性，被归类为1类致癌物[1]、[2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），也称为呕吐毒素，是由镰刀菌产生的一种霉菌毒素，具有免疫毒性[3]。它在储存过程中会污染谷物，从而损害谷物并对整个食物链中的动物和人类健康构成风险，这两种毒素都是普遍存在的污染物[4]。欧盟委员会为谷物及其衍生物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON和AFB1制定了最大限量（MLs），分别为750 μg/kg和2 μg/kg。相比之下，中国的法规标准将各种谷物中的AFB1限量设定在5至20 μg/kg之间，而禽类复合饲料中DON的最大允许水平为≤5000 μg/kg。因此，开发AFB1和DON的检测方法对于减轻人类健康风险和防止因污染造成的重大经济损失至关重要[5]、[6]。
利用基因编辑原理的CRISPR-Cas检测技术由于其高灵敏度、特异性和可编程性，在霉菌毒素检测领域得到了越来越多的应用[7]、[8]。已经开发了多种基于CRISPR-Cas12a的平台来检测黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B1和赭曲霉毒素A[9]、[10]、[11]。然而，这些平台大多使用适配体作为识别元件，霉菌毒素与适配体的结合会激活或抑制Cas12a的切割活性，从而调节报告核酸的切割以生成可检测的信号。虽然抗体相比适配体具有更好的稳定性和亲和力，并广泛用于免疫测定，但将抗体整合到CRISPR-Cas12a系统中受到从非核酸目标高效信号转导的挑战。抗体-寡核苷酸结合技术通过实现核酸介导的Cas12a激活克服了这一障碍[12]。然而，大多数现有方法依赖于生物素-链霉亲和素连接，尽管多价性提供了有限的放大效果，但容易发生非共价解离、空间阻碍和可变结合效率等问题，这些问题会影响信号转导的稳定性[13]、[14]。相比之下，无铜点击化学——特别是菌株诱导的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）反应，使用二苯并环辛炔（DBCO）和叠氮化物——能够形成稳定的共价三唑键，具有出色的生物正交性和效率[15]。这种方法提高了抗体-DNA结合的可靠性，从而优化了CRISPR-Cas12a系统中的信号转导和级联放大，最终提高了霉菌毒素检测的性能。
核酸放大技术，包括聚合酶链反应（PCR）、杂交链反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）和重组酶聚合酶放大（RPA），已广泛与CRISPR-Cas12a系统结合，以实现超灵敏检测[16]、[17]、[18]。然而，这些方法通常需要复杂的核酸序列设计，这限制了它们的广泛应用。相比之下，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是一种模板独立的聚合酶，可以利用dNTP池延长3’-OH末端，通过更简单的设计实现可编程放大[19]。磁性球形核酸（MSNAs）在磁核上具有密集修饰的核酸，与传统球形核酸相比，具有更好的目标识别能力、磁分离能力和信号放大效果[20]。因此，将它们与CRISPR-Cas12a系统结合可以产生更优越的检测性能。
在这项工作中，我们开发了一种超灵敏的比色传感器，使用CRISPR-Cas12a进行初级信号放大，并结合TdT进行级联放大。该传感器采用无铜点击化学合成抗体-aDNA用于目标识别和信号转导，通过间接竞争反应实现。CRISPR-Cas12a系统与MSNAs作为报告分子进行切割放大。产生的具有3’-OH末端的DNA片段通过TdT使用dATP池延长形成polyA序列。polyA在AuNPs上的非特异性吸附保护它们免受盐诱导的聚集，基于AuNPs的特性实现无标记的比色检测和高信号输出。这实现了AFB1和DON的超灵敏比色检测。我们选择了AFB1和DON作为典型的霉菌毒素目标。在优化过程中，我们评估了检测限、线性范围、特异性、批间变异系数和实际样品中的回收率。该方法作为一种CRISPR-Cas12a级联放大生物传感器，适用于食品安全监测、环境检测和医疗保健中的多种目标。
