探索祖先型膨胀蛋白（expansins）的结合特性和活性

古蛋白重建技术（ASR）被应用于枯草芽孢杆菌 BsEXLX1 膨胀蛋白的祖先序列重构，发现其具有更高纤维素结合亲和力、更强的细胞壁松解能力及盐耐受性，揭示了关键残基 substitutions 对功能进化的影响，为工业生物技术中纤维素改性提供新策略。

Ylenia Jabalera|Agustín J. Marín-Peña|Edward Wagner|Daniel J. Cosgrove|Emma R. Master|Raul Perez-Jimenez

CIC bioGUNE，巴斯克研究技术联盟（BRTA），比斯开亚科技园，48160，德里奥，西班牙

摘要

细菌膨胀蛋白是一种非裂解性蛋白质，能够松解纤维素网络，在农业、生物技术和材料科学领域具有广泛应用前景。它们能够破坏纤维素和几丁质等生物聚合物基质中的非共价相互作用，使其成为升级丰富天然材料的宝贵工具。然而，由于其相对于植物膨胀蛋白较低的细胞壁松解活性，其工业应用仍然受到限制。为了解决这一限制，我们采用了祖先序列复活（ASR）技术来重建和表征Bacillus subtilis膨胀蛋白BsEXLX1的古代变体。ASR是一种强大的进化工具，可以推断和合成祖先蛋白质，使研究人员能够探索可能随时间丢失的功能特性。这种方法不仅有助于了解蛋白质的进化过程，还有助于设计具有改进性能的蛋白质，例如提高底物亲和力或结构稳定性。在本研究中，我们结合了生化和生物物理学方法来评估祖先膨胀蛋白的活性和结合行为。研究结果表明，古代变体表现出更强的纤维素亲和力、较低的酸性多糖结合能力以及更强的耐盐性。这些特性增强了它们的细胞壁松解活性，证明了ASR在工程化表面活性蛋白以用于工业应用（特别是在生物质处理和纤维素改性方面）的实用性。

引言

尽管细菌膨胀蛋白与植物膨胀蛋白在进化上存在差异[1]、[2]、[3]，但它们在结构和功能上具有相似性。例如Bacillus subtilis中的BsEXLX1已被证明可以削弱纤维素网络并增强纤维素酶在植物生物质上的活性[1]、[2]、[3]。其作用机制是通过破坏纤维素-纤维素或纤维素-基质界面上的氢键来松解结构，而不会水解多糖链[1]、[4]、[5]。从结构上看，细菌膨胀蛋白由两个结构域组成：N端的双ψ β-桶（DPBB）结构域（D1），类似于糖苷水解酶家族45（GH45）酶；C端的碳水化合物结合模块（CBM63，D2），两者通过一个柔性连接器相连[1]、[6]。膨胀蛋白具有细胞壁松解活性，其作用方式类似于催化剂，可以多次发挥作用。事实上，突变研究已经确定了BsEXLX1中的关键残基（如D82）对这种活性至关重要[2]。膨胀蛋白样蛋白（EXLX）在细菌基因组中的广泛存在突显了它们的生态和生物技术潜力。

尽管具有这些潜力，但细菌膨胀蛋白的特异性活性通常远低于植物α-膨胀蛋白[7]。然而，植物α-膨胀蛋白难以异源表达为活性形式，这限制了其在生物技术应用中的发展。细菌膨胀蛋白活性较低的原因尚不清楚，可能是由于与纤维素的结合亲和力较弱，或者与其他细胞壁成分存在非生产性相互作用[8]，或者它们可能进化出了不同的功能或针对不同的目标。理解这些差异的分子基础对于在生物技术应用中利用膨胀蛋白至关重要，例如生物质分解、生物燃料生产和新型生物材料的开发。探索和增强膨胀蛋白功能特性的一个有前景的方法是祖先序列重建（ASR）。ASR是一种基于现存同源物的系统发育分析来推断和重建古代蛋白质序列的计算和实验策略。该技术使研究人员能够在实验室中重建祖先蛋白质，并研究其结构、稳定性和功能[9]、[10]、[11]。ASR已成功应用于多种蛋白质家族，揭示了进化轨迹，验证了功能假设，并发现了现代蛋白质中丢失或减弱的特性[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。对于像膨胀蛋白这样的表面活性蛋白而言，ASR提供了一个独特的机会来探究底物相互作用机制的进化起源，并识别具有增强或新功能的变体。祖先蛋白质通常比现代后代具有更广的底物特异性、更高的稳定性或更好的结合特性。这些特性对于在具有挑战性的工业条件下（如高盐浓度、可变pH值或复杂的生物质基质）操作的蛋白质工程尤为重要[14]、[16]、[17]。

在本研究中，我们应用ASR来研究Bacillus subtilis细菌膨胀蛋白的进化历史和功能特性。通过重建和表征古代变体，我们旨在确定古代形式是否表现出更强的纤维素结合亲和力和更强的细胞壁松解活性。我们的发现表明，ASR是合理设计用于生物技术的表面活性蛋白的有效工具。

材料

实验中使用的纤维素底物为Avicel（FMC BioPolymer，PH-101，美国宾夕法尼亚州费城）。小麦面粉中的不溶性阿拉伯木聚糖由Megazyme公司提供。软木和硬木（针叶树）在60°C下烘干，由芬兰Lappeenranta的UPM-Kymmene公司提供。小麦胚芽鞘（Triticum aestivum L. cv.SW-50）的制备方法如[18]所述。用于膨胀蛋白纯化的LB培养基（参考编号02-384-500；成分：5克）已预先准备好。

Bacillus subtilis膨胀蛋白的祖先序列复活（ASR）

为了推断已灭绝细菌膨胀蛋白的序列，我们首先使用Bacillus subtilis EXLX1作为查询，在NCBI数据库中检索了77个现存膨胀蛋白序列。这种膨胀蛋白已被充分研究，并且是最早被描述的微生物膨胀蛋白[1]、[6]。检索到的序列来自Firmicutes和Proteobacteria门，它们在超过3亿年前就发生了分化。这种模式可能表明这些蛋白质存在于远古生物中。

结论

我们的研究表明，祖先Bacillus subtilis膨胀蛋白相比现代BsEXLX1具有明显的功能优势，包括更高的纤维素结合亲和力、更强的细胞壁松解潜力以及较低的酸性细胞壁多糖结合能力。这些特性可能是由于进化变化引起的，例如等电点降低以及参与非生产性相互作用的基本残基的自然替代。此外，古代变体还表现出更强的耐盐性。

CRediT作者贡献声明

Ylenia Jabalera：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。Agustín J. Marín-Peña：可视化、方法学、研究。Edward Wagner：撰写 – 原稿、可视化、方法学、研究。Daniel J. Cosgrove：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、监督、方法学、研究。Emma R. Master：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

该项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助（授权协议编号964764）。本文档中的内容代表作者的观点，欧盟委员会不对任何可能使用其中信息的行为负责。Y.J.感谢Juan de la Cierva项目（授权编号FJC2021-047689-I）的财政支持，该项目由西班牙科学与创新部（MICIU/AEI/10.13039/501100011033）资助。