1. 引言
听力损失（Hearing Loss, HL）是全球最常见的感官障碍之一，其中超过50%–80%的先天性病例与遗传因素相关。常染色体隐性非综合征性听力损失（Autosomal Recessive Nonsyndromic Hearing Loss, ARNSHL）约占遗传性听力损失的70%–80%，目前已发现88个相关基因。TMPRSS3（跨膜丝氨酸蛋白酶3）基因是导致ARNSHL的重要致病基因，与语前型（DFNB10）和语后型（DFNB8）听力损失相关。该基因编码的蛋白酶在耳蜗毛细胞、支持细胞、血管纹和螺旋神经元等关键细胞类型中表达。尽管已有超过100个TMPRSS3致病性变异被报道，但剪接位点变异极为罕见，此前仅记录了7例。由于听力损失具有高度的遗传异质性，且存在大量意义未明的变异（Variants of Uncertain Significance, VUS），因此对新型变异进行功能验证至关重要。本研究旨在探究三个中国ARNSHL家系的分子病因，并对五个新型TMPRSS3变异（包括一个非经典剪接位点变异、两个经典剪接位点变异和两个错义变异）进行功能表征。
2. 材料与方法
本研究回顾性分析了中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科遗传性听力损失内部数据库的病例。临床评估包括病史采集、耳镜检查、纯音测听、声导抗和镫骨肌反射测试。听力损失严重程度根据2021年世界卫生组织指南进行分类。
通过全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）和基因Panel测序鉴定候选变异，并经Sanger测序验证。变异筛选优先针对已知的HL相关基因，并根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）指南进行分类。
功能分析包括：1）微型基因（minigene）剪接实验，以评估变异对mRNA剪接的影响；2）基于酵母的功能实验，以评估变异对蛋白酶活性的影响。具体而言，利用pSPL3外显子捕获载体构建了携带三个剪接位点变异（c.205 + 5G>C, c.572 + 1G>A, c.1348-2A>G）的突变体质粒，转染HEK293T细胞后提取RNA，通过RT-PCR和凝胶电泳分析剪接产物。同时，将野生型和突变型TMPRSS3 cDNA克隆到pGBKT7载体，并将其底物上皮钠通道（Epithelial Sodium Channel, ENaC）克隆到pGADT7载体，共转化酵母后，通过酵母在选择性培养基上的生长情况来量化蛋白酶活性。
3. 结果
3.1 临床发现
共研究了三个中国家庭。家系1的先证者为一名30岁汉族男性，表现为进行性、语后性、高频为主的严重感音神经性听力损失，符合DFNB8表型。家系2的先证者为一名6岁汉族男性，表现为语前性严重感音神经性听力损失，在1岁2个月时接受了左耳人工耳蜗植入。家系3的先证者为一名10岁汉族男性，表现为进行性、语前性严重感音神经性听力损失，在2岁10个月时接受了右耳人工耳蜗植入。所有先证者均无双侧前庭功能异常或中内耳结构异常。
3.2 TMPRSS3变异的鉴定
研究鉴定了五个新型TMPRSS3复合杂合变异。在家系1中发现了c.205 + 5G>C和c.923T>C（p.Met308Thr）；家系2中发现了c.572 + 1G>A和c.967G>A（p.Val323Met）；家系3中发现了c.1348-2A>G和c.271C>T（p.Arg91Ter）。根据ACMG指南，c.205 + 5G>C被归类为意义未明变异，c.923T>C为可能致病性，c.1348-2A>G、c.572 + 1G>A为致病性，c.967G>A为意义未明变异。两个错义变异c.923T>C和c.967G>A均位于高度保守的丝氨酸蛋白酶催化结构域内。
3.3 剪接分析
微型基因剪接实验证实，三个剪接位点变异均导致异常剪接。
• 非经典供体位点变异c.205 + 5G>C导致第3外显子完全跳跃，造成111个碱基对的缺失，预计会破坏低密度脂蛋白受体A类（LDL Receptor class A, LDLRA）结构域。
• 经典供体位点变异c.572 + 1G>A产生两种剪接结果：第5外显子完全跳跃（126 bp缺失）或第5外显子内33个碱基对的截短。这两种结果都可能引起清道夫受体半胱氨酸富集（Scavenger Receptor Cysteine-Rich, SRCR）结构域的错误折叠。
• 经典受体位点变异c.1348-2A>G导致第13外显子跳跃。由于第13外显子包含终止密码子，其跳跃会导致读码框移位并并入下游内含子序列，从而形成异常丝氨酸蛋白酶（Serine Protease, SP）结构域。
3.4 突变TMPRSS3蛋白表现出异常的蛋白酶活性
酵母蛋白酶活性实验评估了所有五个新型变体的功能影响。该实验通过TMPRSS3切割其底物ENaC的效率来指示其酶活性，切割效率与酵母在含有蔗糖和抗霉素A的选择性培养基上的生长情况相关。
结果显示，与野生型相比，所有突变体均表现出酶活性显著降低。培养3天后，携带剪接位点变异的酵母菌落几乎不可见，而携带错义变异的菌落虽可检测到，但其平均面积显著小于野生型。培养至第5天，所有变异株的菌落均变得可见，证实了其存活能力。定量分析表明，剪接位点变异导致的生长缺陷比错义变异更为严重。有趣的是，非经典剪接变异c.205 + 5G>C导致的生长缺陷似乎比两个经典剪接变异c.572 + 1G>A和c.1348-2A>G要轻，提示基于剪接位点类型的致病性可能存在梯度差异。
4. 讨论
本研究在三个中国ARNSHL个体中鉴定了五个新型TMPRSS3复合杂合变异。其中剪接位点变异尤为值得关注，它们不仅扩展了TMPRSS3的突变谱，而且比错义变异表现出更严重的致病效应。功能表征证实，这些剪接变异通过破坏正常mRNA加工并导致外显子跳跃，从而更严重地损害蛋白酶功能。
迄今为止，已有10个TMPRSS3剪接位点变异被报道与不同严重程度的听力损失相关。一个模式逐渐清晰：经典剪接位点变异（如c.1195-1G>C和c.783-1G>A）通常导致语前性、重度听力损失，可能是由于完全的外显子跳跃和蛋白质截短。相比之下，非经典变异如c.323-6G>A和本研究中的c.205 + 5G>C往往导致语后性或进行性表型（DFNB8）。这种临床差异可能由部分剪接缺陷解释，其保留了残余的蛋白质功能。
TMPRSS3相关听力损失的分子发病机制已在细胞和动物模型中得到阐明。携带无义变异（Tmprss3 Y206X）的小鼠在出生后第12天开始出现耳蜗毛细胞的退行性病变，证明了该蛋白对毛细胞存活和耳蜗稳态至关重要。机制上，TMPRSS3通过激活ENaC来维持钾离子稳态，并支持内毛细胞正常的向外钾电流。
全球范围内，TMPRSS3变异约占遗传性听力损失病例的0.36%–12%，虽然在最常见ARNSHL基因中不占前列，但其临床重要性在于：与语前（DFNB10）和语后（DFNB8）两种形式的HL相关；表型变异性与变异类型和结构域相关；以及其作为新兴基因治疗靶点的潜力。近期基于腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）的TMPRSS3基因替代疗法已在小鼠模型中成功恢复听力。本研究的发现提示，针对剪接缺陷的反义寡核苷酸疗法可能成为携带剪接位点变异患者的可行治疗策略。
5. 结论
本研究通过功能表征新型剪接位点和错义变异，阐明了它们对蛋白质功能的不同影响，推进了对TMPRSS3相关听力损失的理解。剪接位点变异导致更严重的酶活性损伤，这为患者的表型异质性提供了机制性解释。这项工作强调了在听力损失治疗中采用精准医学方法的必要性，即治疗策略可能需要根据每位患者变异的具体分子后果进行量身定制。随着听力损失基因疗法向临床应用的推进，此类功能研究对于准确匹配患者与合适的治疗干预措施至关重要。将遗传诊断与详细的功能验证相结合，是实现遗传性听力损失个性化医疗的关键一步。
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