Osei Mensah Emmanuel | Ken Nishimura | Kana Morishita | Yujiro Kato | Aya Fukuda | Kimio Sumaru | Koji Hisatake | Masayuki Sano
筑波大学医学研究所基因调控实验室，日本茨城县筑波市Tennodai 1-1-1，邮编305-8575
摘要
基于仙台病毒（SeV）的载体被认为是基因治疗和再生医学中的潜在工具，因为它们可以在不发生染色体插入的情况下表达转基因。我们之前报告过，一种具有复制缺陷且能够持续存在的SeV（SeVdp）载体可以促进体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）。重要的是，siRNA和miRNA介导的SeV RNA依赖性RNA聚合酶的抑制有助于从重编程的细胞中去除SeVdp载体，从而获得不含转基因的iPS细胞。然而，这些方法在很大程度上依赖于转染效率和细胞内的miRNA活性。在这项研究中，我们评估了一种使用抗病毒剂从受感染细胞中消除SeVdp载体的简单方法。GHP-88309是一种针对多种副黏病毒的有效抗病毒化合物，它能够有效抑制SeV的复制并帮助去除SeVdp载体。值得注意的是，这种化合物能够在胚胎干细胞分化后完全清除表达BRN4的SeVdp载体。我们的发现表明，GHP-88309有望提高SeVdp载体在包括转录因子介导的细胞分化在内的各种生物学和医学应用中的实用性和灵活性。
引言
病毒载体已成为高效基因传递不可或缺的工具，因为它们能够将遗传物质引入多种哺乳动物细胞（Dunbar等人，2018年；Zhao等人，2021年）。它们广泛的细胞亲和性、高转导效率以及持久的转基因表达能力使其特别适用于需要精确和长期调节基因功能的应用。在各种类型的病毒载体中，腺相关病毒载体和慢病毒载体实际用于体外和体内基因治疗（Lamsfus-Calle等人，2020年；Pupo等人，2022年）。然而，在增殖细胞中实现长期转基因表达需要将这些病毒基因组整合到宿主染色体中，这引发了临床应用的安全性问题，尤其是在免疫原性和基因毒性方面（Monahan等人，2021年）。此外，转基因的染色体整合还存在插入突变和恶性转化的风险（Hacein-Bey-Abina等人，2003年）。
最近，基于RNA的载体因能够在不发生染色体插入的情况下表达转基因而受到关注（Schott等人，2016年）。仙台病毒（SeV）属于副黏病毒科，其基因组为非分段的负链单链RNA，编码六种主要蛋白质：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大聚合酶蛋白（L）。SeV可以感染多种动物细胞，但对人类没有致病性，使其成为再生医学和基因治疗的潜在工具（Nakanishi和Otsu，2012年）。此外，一种来自SeV Nagoya株的温度敏感突变株Cl.151在非适宜温度38°C下表现出极低的细胞毒性（Yoshida等人，1979年）。在标准细胞培养条件（37°C）下，Cl.151株无法产生具有感染性的病毒颗粒，但其RNA基因组在受感染细胞中保持稳定并继续表达病毒蛋白（Nishimura等人，2007年）。基于SeV Cl.151，我们通过完全删除病毒基因组中的M、F和HN基因，构建了一种具有复制缺陷且持续存在的SeV（SeVdp）载体（Nishimura等人，2011年）。在受感染细胞中，SeVdp载体能够在不发生染色体整合的情况下稳定表达转基因，并允许多个转基因的同时高效表达。这些特性对于需要高水平和持续表达多种转录因子的体细胞重编程特别有利（Nakanishi和Otsu，2012年）。我们报告称，携带OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的SeVdp载体能够有效将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）（Nishimura等人，2011年；Nishimura等人，2017年）。此外，在重编程过程后，SeVdp载体可以从iPS细胞中完全清除（Nishimura等人，2011年；Nishimura等人，2017年）。由于表达细胞特异性转录因子的SeVdp载体不仅可能促进细胞重编程，还可能促进多种类型干细胞的分化（Kishimoto等人，2024年），因此从受病毒载体感染的细胞中完全清除SeVdp载体对于生成适用于细胞治疗和再生医学的无转基因细胞至关重要。
通过抑制SeV RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的关键成分SeV L蛋白，可以实现SeVdp载体的清除。我们之前报告过，siRNA或miRNA介导的SeV L蛋白表达抑制有助于从受病毒载体感染的细胞中去除SeVdp载体（Nishimura等人，2011年；Nishimura等人，2017年）。尽管这些方法可以完全去除SeVdp载体，但每种方法仍有局限性：siRNA介导的去除方法高度依赖于转染效率，而miRNA介导的方法则依赖于细胞特异性miRNA的表达和活性。
为了克服这些局限性，抗病毒化合物成为消除SeVdp载体的有吸引力的选择。抗病毒化合物通常分为三类：核苷/核苷酸类似物、非核苷抑制剂和突变剂（Palazzotti等人，2024年）。核苷/核苷酸类似物模仿天然核苷酸，在磷酸化后掺入病毒基因组，从而通过链终止抑制病毒复制（Deval，2009年）。阿昔洛韦和索非布韦分别是针对疱疹病毒DNA聚合酶和HCV RNA聚合酶的代表性例子（Kłysik等人，2020年；Murakami等人，2010年）。非核苷抑制剂如依非韦伦和奈韦拉平结合到病毒聚合酶的别构位点，导致聚合酶活性下降（Li等人，2022年）。某些核苷类似物，如利巴韦林，还会通过引入过多突变来发挥突变作用，最终导致致命的基因突变（Graci和Cameron，2006年）。研究表明，利巴韦林对包括SeV在内的多种RNA病毒有效（Beaucourt和Vignuzzi，2014年；Crotty等人，2000年；Larson等人，1976年）。先前的研究证明，利巴韦林可以抑制SeV载体的复制，从而逐渐减少病毒颗粒的数量（Sasaki等人，2005年）。最近的一项高通量筛选发现，GHP-88309是一种非核苷类病毒聚合酶抑制剂，对多种副黏病毒具有广谱抗病毒作用（Cox等人，2020年）。GHP-88309结合到副黏病毒L蛋白中心腔内的保守口袋中，抑制病毒RNA合成的起始阶段（Cox等人，2020年）。
在这项研究中，我们研究了利巴韦林和GHP-88309对从受感染细胞中清除SeVdp载体的效果。虽然这两种化合物都能有效抑制SeVdp的复制，但GHP-88309的细胞毒性明显低于利巴韦林。GHP-88309能够高效地从多种细胞类型中去除SeVdp载体，包括从小鼠胚胎干细胞（mESCs）衍生出的神经干细胞（NSCs）。此外，GHP-88309与核糖核酸酶联合使用，通过切割SeV L mRNA，产生了协同效应，加速了载体的清除。这些发现表明，GHP-88309是一种能够提高SeVdp载体实用性和灵活性的有效化合物。
细胞培养
HeLa（RIKEN BRC）、HCT116（RIKEN BRC）和NIH3T3（ATCC）细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；HyClone Laboratories，美国犹他州Logan）和青霉素-链霉素（Fujifilm Wako）的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。
抗病毒实验
SeV(BsR/EGFP/Fluc) [先前描述为]
抗病毒化合物对抑制受感染细胞中SeVdp载体复制的影响
我们之前已经证明，通过阻断SeV RdRp活性来抑制SeVdp载体的复制可以减少受感染细胞中的载体数量（Nishimura等人，2011年；Nishimura等人，2017年）。为了评估抗病毒化合物对SeVdp载体复制的影响，我们使用了含有blastidin S脱氨酶（BsR）、EGFP和萤火虫荧光蛋白（Fluc）基因的SeV(BsR/EGFP/Fluc)载体（图S1A）（Sano等人，2022年）。
结论
在这项研究中，我们证明了小分子化合物GHP-88309能有效抑制SeVdp载体的复制。该化合物具有相对较低的毒性，并能够高效地从受感染细胞中清除SeVdp载体。此外，我们发现结合多种策略抑制SeV RdRp活性可以显著增强载体的清除效果。尽管在本研究中GHP-88309与SrC开关系统结合使用，但还可以采用多种组合方法。
CRediT作者贡献声明
Kimio Sumaru： 方法学。
Aya Fukuda： 资源准备。
Masayuki Sano： 写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析、概念化。
Koji Hisatake： 写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析。
Ken Nishimura： 写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析。
Osei Mensah Emmanuel： 写作——初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析。
Yujiro Kato： 资源准备。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
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