无载体的纳米重塑剂能够突破与癌症相关的成纤维细胞屏障，缓解免疫抑制现象，从而协同增强免疫疗法的效果

本研究通过单步骤金属配位自组装策略，开发无载体纳米重塑剂QN NP，协同锰离子（Mn²⁺）、槲皮素（Qc）和IDO1抑制剂NLG919，克服实体瘤的ECM物理屏障和免疫抑制微环境，增强免疫细胞浸润与抗肿瘤疗效，并与抗PD-L1抗体产生协同作用。

李松岩|岳一|杜金涛|赵文|刘冰汉|马子琳|王学春|魏玉华|宋聪|张贵强

山东第一医科大学附属山东省医院 & 山东省医学科学院，济南，山东 250021，中国

摘要

密集的细胞外基质和免疫抑制性微环境形成了双重物理和免疫屏障，这常常导致免疫疗法在实体瘤中的效果不佳。本文中，我们采用了一种“一锅法”技术，通过将锰离子（Mn²⁺）与槲皮素（Qc）以及吲哚胺2,3-双加氧酶1抑制剂NLG919结合，开发出一种无载体的纳米重塑剂（QN NP），以克服这些限制。QN NP具有均匀的粒径和出色的稳定性，能够高效积聚在肿瘤组织中，并根据肿瘤微环境触发药物释放。槲皮素作为活性药物成分，可以调节癌相关成纤维细胞的活性并减少细胞外基质的沉积；锰离子（Mn²⁺通过产生羟基自由基诱导免疫原性细胞死亡以及激活干扰素基因刺激因子（STING）通路来增强免疫反应；NLG919则通过干扰色氨酸/犬尿氨酸代谢途径来缓解肿瘤的免疫抑制作用。这三者的协同作用共同克服了物理屏障和免疫抑制环境，从而增强了免疫细胞的浸润和效应功能。此外，将QN NP与抗PD-L1抗体结合使用时，显示出显著的协同效应，能够协同抑制原发肿瘤的生长和肺转移。这种无载体的纳米重塑策略有效应对了肿瘤间质纤维化和免疫逃逸的双重挑战，为基于物理屏障破坏和微环境重编程的联合免疫疗法开发提供了新的途径。

引言

癌症治疗近年来取得了多项突破性进展，从早期的外科手术和传统化疗/放疗发展到精准靶向治疗和免疫疗法时代，治疗方法日益多样化[1]、[2]、[3]。然而，肿瘤本身的生物学异质性，尤其是其免疫抑制性微环境（TME），仍然是限制治疗效果的根本性因素[4]、[5]。在实体瘤中，密集的细胞外基质（ECM）和高度免疫抑制的TME形成了双重屏障，不仅阻碍了药物的积累和渗透，还抑制了免疫效应细胞的浸润、激活和功能发挥，导致药物耐药性的增加和治疗效果不佳[6]、[7]、[8]、[9]。这种治疗挑战在乳腺癌和胰腺癌等间质丰富的肿瘤中尤为突出，因此迫切需要开发能够同时应对这两种障碍的创新策略。

免疫疗法已成为癌症治疗的主要方法之一，免疫检查点抑制剂（ICIs）在多种恶性肿瘤中表现出持久的治疗效果[10]、[11]。然而，ICIs的疗效受到肿瘤免疫原性低和TME免疫抑制环境的严重限制[12]、[13]。TME中存在大量的免疫抑制细胞，包括调节性T细胞（Tregs）和促进肿瘤生长的M2极化巨噬细胞（M2-polarized macrophages），以及活化的癌相关成纤维细胞（CAFs）[14]、[15]、[16]。CAF通过其纤维生成活性分泌过多的细胞外基质成分（如胶原蛋白I/III和纤维连接蛋白），形成物理屏障，阻碍药物递送并抑制免疫细胞浸润[17]、[18]。同时，CAF还会释放免疫抑制性细胞因子（如转化生长因子-β（TGF-β）和白细胞介素-6（IL-6），进一步抑制免疫细胞活性，导致肿瘤呈现“冷”表型[19]、[20]。因此，针对CAF介导的纤维化并重塑免疫抑制性TME已成为提高免疫疗法效果的关键策略。

纳米技术赋能的免疫疗法是一种变革性策略，能够同时解决物理屏障和免疫抑制性问题，从而增强免疫疗法的效果[21]、[22]。基于纳米颗粒（NP）的药物递送系统通过提高药物的溶解度、稳定性和肿瘤靶向性，优化了治疗效果，并克服了生物屏障，增加了药物在肿瘤组织中的积累。此外，这些NP基系统还能实现多种疗法（如化疗、化学动力学疗法（CDT）和光热疗法）的联合应用，有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD），将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤表型，从而增强免疫疗法的效果[23]、[24]。在之前的研究中，我们团队开发了一种pH响应性的核壳树状大分子（CSTD）纳米载体，通过同时递送CD47 siRNA和多柔比星来增强免疫识别。当与抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4抗体结合使用时，该系统能够促进M1巨噬细胞的极化和T细胞的激活，从而抑制小鼠的原发和远处乳腺肿瘤[25]。基于这些及其他概念验证结果，纳米医学正在向能够改变临床实践的联合疗法方向发展。然而，传统NP基系统的临床转化面临一些挑战，包括不可降解的纳米载体和药物装载量不足的问题[26]、[27]。因此，开发能够精确递送功能性药物的新策略对于增强肿瘤特异性免疫反应和治疗效果至关重要。

无载体纳米颗粒（CFNPs）是一种创新方法，具有独特的优势，有助于解决临床转化中的问题[28]。与传统纳米载体不同，CFNPs完全或主要由活性药物成分（APIs）自组装而成，这一过程具有多个关键优势：（i）简化了制备流程，避免了传统纳米载体所需的复杂合成和纯化步骤；（ii）显著提高了药物装载效率（某些系统的药物装载率超过90%）；（iii）完全避免了不可降解纳米载体可能带来的长期毒性问题[29]、[30]。值得注意的是，金属配位（如锌、铁或锰离子（Mn²⁺）常被用于驱动CFNPs的自组装[31]、[32]。这种策略不仅提高了CFNPs的稳定性，还允许精确控制金属离子在体内的分布，为金属免疫疗法的发展开辟了新途径[33]、[34]。以Mn²⁺为例，这些离子不仅作为CFNPs的结构支架，还通过促进CDT和激活STING通路来增强抗肿瘤免疫反应[35]、[36]。

先前的研究表明，槲皮素（Qc）可以下调CAF的表达，从而重塑细胞外基质[37]、[38]。然而，由于其水溶性差、生物利用度低和细胞渗透性有限以及脱靶效应，Qc的临床应用受到限制。在本研究中，我们开发了一种无载体的纳米重塑剂（QN NP），通过同时克服CAF屏障和免疫抑制作用来协同增强免疫疗法的效果。QN NP是通过锰离子（Mn²⁺、槲皮素（Qc）和吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）抑制剂NLG919的自组装形成的（图1A）。这种“一锅法”合成工艺使得QN NP能够轻松且可规模化地制备，具有高生理稳定性、均匀的粒径分布和优异的可重复性。QN NP的治疗机制如图1B所示。系统给药后，带负电的QN NP通过增强渗透性和保留效应（EPR）以及在TME中由谷胱甘肽（GSH）/pH触发的解体作用，在肿瘤组织中积累。释放的槲皮素可以调节CAF的活性并减少细胞外基质的沉积，从而增强免疫细胞的浸润。释放的锰离子（Mn²⁺通过Fenton反应产生羟基自由基，促进ICD，并激活STING通路，进一步增加免疫细胞的招募。同时，NLG919抑制IDO1的活性，干扰色氨酸/犬尿氨酸（Trp/Kyn）代谢途径，减少Tregs的浸润，从而缓解肿瘤的免疫抑制。这三者的协同作用共同克服了CAF引起的物理屏障和免疫抑制环境，显著增强了抗肿瘤免疫反应。当与ICIs（如抗PD-L1抗体）结合使用时，该策略能够协同抑制原发肿瘤的生长和肺转移。与以往的研究相比，本工作的创新之处在于将这些治疗成分合理整合到一个序贯协同平台上[39]、[40]。该平台不仅实现了高药物装载率和治疗效果的精确控制，还通过“一体化”设计系统性地克服了TME中的多重障碍。体外和体内的实验均证实，制备的NP显示出比单独成分组合更显著的治疗效果，体现了“1+1+1>3”的协同效应。这种无载体的纳米重塑策略同时解决了肿瘤间质纤维化和免疫逃逸问题，为下一代纳米药物的开发提供了蓝图，这些药物能够重塑免疫抑制性TME并破坏物理屏障。

QN NPs的合成

首先分别制备所有原料溶液：将槲皮素（Qc，5 mg/mL）和NLG919（11.3 mg/mL）溶解在乙醇中，将MnCl₂·4H₂O（40 mM）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP，10 mg/mL）溶解在超纯水中。将Qc（100 μL）、NLG919（100 μL）和MnCl₂（35 μL）充分混合后，加入含有100 μL PVP的稳定缓冲液中。反应混合物在25°C下搅拌16小时，随后获得QN NPs。

QN NPs的制备与表征

在本研究中，通过槲皮素（Qc）、NLG919和锰离子（Mn²⁺的自组装，一步合成了无载体纳米重塑剂（QN NP）（图1A）。通过调整Qc与NLG919的摩尔比，优化了纳米颗粒的组装行为（图1A）。透射电子显微镜（TEM）观察结果显示，Qc与NLG919的摩尔比为2:5时，纳米颗粒的制备效果最佳。

结论

总结来说，我们开发了一种无载体纳米重塑剂（QN NP），通过一步金属配位驱动的自组装策略实现了乳腺癌的协同免疫治疗。通过同时装载锰离子（Mn²⁺、槲皮素（Qc）和NLG919，该纳米重塑剂的药物装载效率高达90.1%（w/w），并且具有优异的胶体稳定性和对TME环境响应的释放特性。体外和体内实验均证明，这些成分赋予QN NP多方面的抗肿瘤协同作用。

CRediT作者贡献声明

李松岩：撰写初稿、数据可视化、项目管理、研究设计、资金申请、数据管理、概念构思。岳一：项目管理、方法设计、研究实施、数据管理。杜金涛：方法设计、研究实施、数据分析。赵文：验证实验、方法设计、数据分析。刘冰汉：数据可视化、项目管理、研究实施。马子琳：项目管理、方法设计、研究实施。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2024QB346、ZR2023MB081、ZR2025MS1390）、山东省中医药技术项目（Q-2023002、Q-2023127）以及山东第一医科大学与山东省医学科学院医学科技创新中心的“大型仪器设备开放共享基金”（KCZX2024A008、KCZX2024A012）的财政支持。