KRAS是人类癌症中最著名的致癌驱动因子，其在90%的胰腺腺癌（PDAC）、30-50%的结直肠癌（CRC）和30%的非小细胞肺癌（NSCLC）中存在单核苷酸突变（[1], [2], [3]）。值得注意的是，大约98%的这些突变发生在G12、G13或Q61密码子（[4], [5], [6], [7]），其中G12D突变最为常见（[1], [8]）。因此，KRAS基因的突变状态已成为疾病诊断和指导治疗决策的公认生物标志物。例如，携带G12D突变的患者对西妥昔单抗治疗表现出原发性耐药性（[5], [9]）。因此，NCCN指南继续要求所有患者在接受抗EGFR治疗前进行KRAS突变检测，这一要求自2009年以来一直保持不变（[10], [11]）。此外，KRAS突变在多种癌症中的高发率使其成为药物开发的优先分子靶点。索托拉西布（Sotorasib）是首个获得FDA批准的KRAS G12C抑制剂，加速了针对KRAS的药物发现创新（[12], [13]）。此外，几种有前景的KRAS G12D抑制剂已进入I/II期临床试验，包括RMC-9805（Revolution Medicines）、HRS-4642（江苏恒瑞医药）、TH-Z835（清华大学）和MRTX1133（Mirati）（[14], [15]）。值得注意的是，任何KRAS G12D抑制剂的临床批准都将使常规检测该突变成为治疗的必要前提。
聚合酶链反应（PCR）和下一代测序（NGS）是检测基因突变最常用的方法（[16], [17], [18]）。然而，传统PCR受到多步骤过程的限制，需要额外的独立热循环仪，并且多重检测能力有限（[19]）。而NGS则受到高成本、复杂的数据分析和长周转时间的制约（[20]）。因此，迫切需要开发更便捷、经济高效且高度特异性的方法来检测实际应用中的核苷酸多态性。近年来，等温扩增技术迅速发展成为核酸检测的关键工具。它们能够在恒定温度下扩增目标，无需复杂仪器，特别适用于资源有限的环境（[21], [22], [23]）。其中，滚环扩增（RCA）是一种强大的等温技术，可以精确地用于基因突变检测和超灵敏的生物传感（[24], [25], [26], [27]）。简而言之，目标基因本身作为模板引导锁形探针的环化，这一过程完全依赖于突变位点的精确碱基配对。只有当探针与突变序列完全互补时，连接才能成功进行，然后闭合的环状探针作为模板进行RCA，生成长的重复DNA产物。然而，传统的RCA方法容易受到连接酶介导的非特异性环化的影响，导致假阳性信号（[28], [29]）。DNA连接酶的基本机制涉及识别和封闭双链DNA中的缺口，这一过程主要由DNA末端的空间接近性驱动，而不是序列特异性（[30], [31]）。因此，在高酶浓度或DNA浓度等非理想条件下，DNA连接酶可以连接任何具有兼容3’-OH和5’-P末端的共定位末端，包括来自非同源片段或错配DNA的末端。换句话说，仅依赖DNA连接酶特异性的RCA突变检测具有较低的能量阈值。这种低阈值允许部分错配的靶标分子发生连接，从而产生假阳性信号。因此，通过设计高能量阈值的系统可以实现高保真度，从而防止能量不足的靶标引起不必要的激活。
总之，在本研究中，我们描述了一种协同识别策略，将杂交和连接识别机制结合到一个哑铃探针中，实现了对KRAS G12D突变的高特异性和可视化检测，具有单碱基分辨率。具体来说，我们通过将单链DNA寡核苷酸折叠成哑铃结构来设计了一个多功能哑铃探针（mFDP）。该mFDP结构包括一个带有中央一个碱基间隙的双链茎和两个侧面的单链环。只有当目标基因满足两个前提条件时，RCA反应才会被激活以产生强烈的视觉信号：首先，它竞争性地杂交以破坏mFDP的双链茎；其次，它作为模板引导mFDP的环化。这种两步机制建立了高能量阈值，防止了低亲和力非靶标的随意激活，实现了卓越的检测特异性。我们认为，这种提高能量阈值的协同识别策略为稳健且高度特异的检测提供了一个有前景的框架。
