在微生物耐药性日益严峻的全球公共卫生挑战面前，寻找新型、高效的抗菌和抗生物膜制剂显得尤为迫切。同时，抗癌药物的研发也需不断探索新靶点和作用机制。L-天冬酰胺酶（L-ASNase）作为一种能够水解L-天冬酰胺的酶，在血液系统恶性肿瘤的治疗中已有应用，但其在对抗细菌感染、特别是破坏细菌生物膜方面的潜力，以及其可能的广谱细胞毒性，仍是一个值得深入探索的领域。传统的微生物来源酶在活性和稳定性上可能存在局限，因此，从多样化的环境样本中筛选具有高产和高活性L-天冬酰胺酶的新菌株，并全面评估其生物活性，成为一项有前景的研究方向。这项研究旨在回答：我们能否从环境中找到能高效产L-天冬酰胺酶的真菌？这些酶是否具备对抗多种病原菌和癌细胞的多重生物活性？其潜在的作用机制是什么？为了回答这些问题，研究人员开展了系统的研究，相关成果发表在《AMB Express》上。
为开展本研究，作者运用了微生物分离与筛选、酶学表征、生物活性评估及计算生物学分析等多种技术方法。具体而言，研究从污水和土壤环境样本中分离真菌。通过平板检测法筛选产L-天冬酰胺酶的菌株，并对其发酵条件（碳源、氮源、pH、温度）进行优化以获得最大酶产量。采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）对酶蛋白进行鉴定。抗菌活性通过最低抑菌浓度（MIC）实验评估，抗生物膜活性通过定量生物膜抑制实验测定。细胞毒性采用MTT法（一种检测细胞存活和生长的方法）针对MCF-7（人乳腺癌细胞系）和HepG2（人肝癌细胞系）进行评估。计算分析部分则运用了分子对接和分子动力学模拟来探究酶与底物L-天冬氨酸的结合模式与复合物稳定性。
研究结果
1. 真菌分离与L-天冬酰胺酶生产菌株筛选
从污水和土壤中共分离到14种真菌，其中10株在平板检测中显示胞外L-天冬酰胺酶阳性。其中，构巢曲霉（Aspergillus nidulans）AUMC17371、烟曲霉（A. flavus）AUMC17373、烟曲霉（A. flavus）AUMC17374和土曲霉（A. terreus）AUMC17372显示出最高的酶活性，分别为1.35、1.25、0.97和0.79 U/mL。
2. 培养条件优化
通过优化发现，以果糖为碳源、天冬酰胺为氮源、pH 6、30°C的培养条件下，L-天冬酰胺酶的产量最高。SDS-PAGE分析证实了酶蛋白的产生，显示蛋白条带分子量在35至45 kDa之间。
3. 抗菌与抗生物膜活性
抗菌筛选显示，这些L-天冬酰胺酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有强活性，但对白色念珠菌（Candida albicans）的抗真菌效果有限。MIC结果表明，来自构巢曲霉AUMC17371的L-天冬酰胺酶对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌作用最强；其次是烟曲霉AUMC17373来源的酶，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）有效。抗生物膜实验表明，抑制率在22%至69%之间，其中烟曲霉AUMC17373来源的酶显示出最强的抗生物膜效果。
4. 细胞毒性（抗癌）活性
细胞毒性测试显示，烟曲霉AUMC17374来源的酶对MCF-7和HepG2细胞系具有抗癌活性，其IC50（半抑制浓度）值分别为184和450 µg/mL。
5. 计算分析支持
分子对接分析表明，L-天冬氨酸与构巢曲霉AUMC17371来源的L-天冬酰胺酶能稳定结合，结合自由能为-4.67 kcal/mol。分子动力学模拟进一步表明，该酶-底物复合物在结构上是稳定的，这从计算角度支持了其酶学功能的可行性。
结论与讨论
本研究成功从环境样本中分离到多株能产L-天冬酰胺酶的真菌，并证实了所产酶具有多重生物活性。综合来看，构巢曲霉AUMC17371和烟曲霉AUMC17373来源的酶在抗菌（特别是对抗金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）和抗生物膜方面表现突出，而烟曲霉AUMC17374来源的酶则显示出对乳腺癌和肝癌细胞系的细胞毒性。计算生物学分析为这些酶的功能提供了机制层面的见解，表明其与底物能够形成稳定的复合物。这些结果共同表明，真菌来源的L-天冬酰胺酶不仅是一种潜在的抗菌剂，能够对抗包括耐药菌在内的病原体并抑制其生物膜形成（生物膜是导致慢性感染和耐药性增强的关键因素），还可能是一种具有抗癌潜力的生物制剂。这项研究的意义在于，它拓宽了L-天冬酰胺酶的应用范畴，从传统的白血病治疗延伸至抗感染和抗实体瘤领域，为开发基于酶疗法的多功能治疗候选药物提供了新的资源和理论依据。尤其是其对临床常见且易形成生物膜的病原菌（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）的有效性，以及其对癌细胞的选择性毒性，提示其具有值得深入开发的潜力。未来的研究可聚焦于酶的纯化、工程化改造以提高其活性与稳定性，并在更复杂的感染模型和动物模型中验证其疗效与安全性。
