通过鼻内接种三价流感病毒神经氨酸酶蛋白与保守的HCA2序列（这些序列被融合到一个经过环状置换的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位上）来进行初次和加强免疫

重组神经氨酸酶联合黏膜佐剂诱导跨亚型免疫保护。

洪浩灿 | 鄭凱文 | 程焕宇 | 謝和辰 | 陳忠初 | 蔡世哲 | 周世哲 | 劉文春 | 吳淑珍

国立清華大學生物技術研究所，新竹30013，臺灣

摘要

为了开发黏膜性流感疫苗，我们使用了三价重组神经氨酸酶（NA）蛋白，并结合了经过环状置换的大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚基LTB(TT)作为黏膜佐剂。重组四聚体NA蛋白——N1*（具有N329/K331T糖基掩蔽突变）、N2和BN——是利用Staphylothermus marinus的四聚化结构域或人类血管扩张刺激磷酸蛋白设计的，并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产。为了增强免疫反应，将具有三个串联重复序列的保守HCA2序列基因融合到LTB(TT)中，在大肠杆菌中表达，并与三价NA蛋白一起鼻内给药。BALB/c小鼠接受了三剂或四剂的基础-加强免疫方案。在三剂方案中，接受10 μg N1*、N2和BN以及10 μg LTB(TT)或15 μg LTB(TT)-HCA2的小鼠，其针对H3N2和B型流感的IgG、NA抑制（NAI）和病毒复制抑制抗体滴度高于H1N1。将N1*剂量增加到15 μg并未增强免疫反应。尽管对H1N1的抗体反应较弱，但对H3N2和B型流感病毒的抗体滴度较高，所有接受三价NA配方与LTB(TT)-HCA2联合免疫的小鼠在H1N1和H3N2病毒挑战后均表现出完全的保护作用和体重完全恢复。在四剂方案中，使用三价NA抗原与LTB(TT)、LTB(TT)-HCA2或LTB(TT)-HCA2 + poly I:C的组合，对H3N2和B型流感的反应更强。尽管如此，所有接受免疫的小鼠在H1N1病毒挑战后均存活率为100%且体重完全恢复。虽然四剂基础-加强免疫方案诱导了对H7N9的交叉亚型血清抗体反应，但相应的黏膜抗体反应相对较弱，未能提供保护性免疫。这些发现支持了一种替代的流感疫苗开发策略，即以NA的四聚体外域作为疫苗抗原，并结合鼻内给药、黏膜佐剂和保守的HCA2序列来推进潜在的通用流感疫苗平台。

引言

流感病毒分为四种亚型：A、B、C和D型。A型和B型流感病毒常见于人类并引起季节性流行病。A型流感病毒亚型根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）糖蛋白的抗原特性进行分类，分别标记为H1–H19和N1–N11 [15]，[38]。B型流感病毒分为两个谱系：B/Yamagata和B/Victoria；然而，在COVID-19大流行之后，B/Yamagata谱系已经消失 [2]，[4]，[10]，[24]，[36]。在通用流感疫苗的开发中，NA最近因其相对较低的抗原漂移性而成为有前景的目标 [22]，[23]。其他值得注意的候选抗原包括HA茎部、HA球状头的特定区域、M2（M2e）的体外域和核蛋白（NP）[5]，[25]，[26]，[42]。NA的免疫原性首次在人类自然感染或接种疫苗后被观察到 [6]。NA抑制（NAI）抗体已被证明可以减少病毒复制和释放 [30]，与保护作用相关 ([7]；Memoli等人，2016年），并与疾病严重程度、症状负担和病程呈负相关 [25]。最近，几种针对NA的单克隆抗体显示出对多种流感病毒株的广泛保护作用 [31]，[34]，[39]，[43]，[44]，[45]，[46]。

为了增强NA引发的免疫反应，正在探索多种策略，包括混合不同菌株的NA蛋白、计算设计共识NA抗原，以及在单个颗粒上呈现多种菌株的异源多价NA [5]。NA的酶活性位点有助于水解唾液酸，从而促进病毒出芽和子代病毒体的释放，该位点高度保守，是通用疫苗设计的理想目标。在A型和B型流感病毒的NA序列多样性中，已经鉴定出一个普遍保守的序列——称为HCA2——位于酶的活性位点附近 [11]，[12]，[17]。HCA2由9个氨基酸序列组成：在A型流感病毒中为ILRTQESEC，在B型流感病毒中为ILRTQESAC。单克隆抗体1G01 [39]，[46] 已证明其能够提供对所有A型和B型流感病毒的广泛保护。在这项研究中，将HCA2序列的三个串联重复序列基因融合到经过环状置换的大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚基LTB(TT)中，在大肠杆菌中表达，并与三价NA蛋白一起鼻内给药给BALB/c小鼠。我们采用了三剂或四剂的基础-加强免疫方案来评估系统性和黏膜免疫反应。这些指标包括血清中的抗NA IgG滴度、NAI和病毒复制抑制滴度，以及支气管肺泡灌洗液（BALFs）中的黏膜IgA和IgG水平，针对A型（H1N1、H3N2、H7N9）和B型流感病毒。最后，我们评估了对H1N1、H3N2和H7N9病毒挑战的保护作用。

细胞和病毒

Sf9细胞在Sf-900 II无血清培养基（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，添加了100单位/mL青霉素-链霉素（P/S）（Thermo Fisher Scientific，美国），培养温度为28°C，既可以作为摇瓶中的悬浮培养也可以作为培养皿中的贴壁培养。MDCK细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，美国）中维持，添加了100单位/mL P/S和5%胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，美国）

结果

构建、表达并表征了与普遍保守的HCA2序列融合的三价NA蛋白和LTB(TT)佐剂。

为了从A型和B型流感病毒中获得重组NA蛋白，我们构建了含有gp67信号肽、6-His标签和来自人类血管扩张刺激磷酸蛋白（HVSP）或Staphylothermus marinus的TB的四聚化序列的杆状病毒表达载体。

讨论

在这项研究中，我们证明了使用三价重组NA蛋白——N1*、N2和BN——与黏膜佐剂LTB(TT)-HCA2进行鼻内基础-加强免疫，在三剂和四剂方案中均引发了强烈的免疫反应。免疫组在血清和BALFs中显示出显著升高的NAI滴度和病毒复制抑制抗体，特别是对H3N2和B型流感病毒的强烈反应。

CRediT作者贡献声明

洪浩灿：研究、数据分析。郑凱文：数据分析。程焕宇：研究、数据分析。谢和辰：数据分析。陈忠初：资源获取、资金筹措。周世哲：方法学、研究、概念构思。刘文春：资源获取、研究、数据分析。吴淑珍：写作——审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、研究、资金筹措、数据分析。

伦理声明

本文不包含任何涉及人类的实验工作。涉及小鼠的程序遵循了国立清華大學（NTHU）实验室动物中心和中科院传染病核心设施ABSL-2实验室制定的指南。动物使用方案由NTHU机构动物护理和使用委员会（IACUC）（协议编号NTHU-IACUC-11210H044）审查和批准。所有涉及病毒挑战研究的程序均获得批准

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢加拿大卫生部的Xuguang（Sean）Li博士提供了抗HCA2单克隆抗体。这项工作得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC114-2327-B-007-001）、国立清華大学（115QF029E1）和新竹MacKay纪念医院（MMH-HB-11313）的支持。