随着肿瘤免疫治疗、CAR-T细胞疗法等创新生物疗法的蓬勃发展，如何确保其在有效攻击疾病的同时，不引发危险的免疫相关不良反应，已成为决定其临床成功与否的关键门槛。在诸多潜在风险中，细胞因子释放综合征（CRS）尤为凶险，它如同免疫系统的一场不受控制的“风暴”，短时间内大量细胞因子释放可导致全身性炎症反应，严重时可引起多器官衰竭甚至死亡。2006年，TGN1412（一种抗CD28超级激动剂）在I期临床试验中引发的严重CRS事件，就给整个行业敲响了警钟。因此，在生物疗法进入临床试验前，如何更准确、更可靠地预测其诱发CRS的风险，是药物研发领域亟待解决的核心难题。
传统的非临床安全评估，如使用体外细胞实验或非人灵长类动物模型，常因物种特异性差异或无法模拟体内复杂的免疫网络交互，而在预测人体反应时存在偏差。例如，TGN1412在食蟹猴模型中的测试就未能预测到其在人体中观察到的灾难性后果。人源化小鼠模型，即将人类免疫细胞或干细胞植入免疫缺陷小鼠体内，为在活体动物中研究人类特异性免疫反应提供了可能。然而，不同实验室使用的人源化模型、评估方法和标准参差不齐，导致结果难以比较和整合，阻碍了其作为可靠预测工具的广泛应用。
为了应对这一挑战，发表于《Frontiers in Immunology》的这项研究，首次利用一个国际协作研究中已验证的标准化单克隆抗体参考库（NIBSC代码 19/156），对两种主流的人源化小鼠模型——人脐带血造血干细胞（HSC）植入模型和人外周血单个核细胞（PBMC）植入模型——进行了系统性的体内评估。该参考库包含三种已知在临床上可诱发不同程度CRS的阳性对照抗体（抗CD28-SA、抗CD3、抗CD52）及其同型对照，旨在为评估和标准化临床前模型的预测能力提供一把“标尺”。
研究人员在研究中整合运用了多项关键技术。他们首先建立了HSC和PBMC两种人源化NSG小鼠模型，并利用流式细胞术长期监测了人免疫细胞（如CD45+ 、CD3+ T细胞、CD20+ B细胞等）的植入动力学和表型。随后，向模型小鼠静脉注射参考抗体库中的抗体，并在多个时间点采集血浆，使用MSD（Meso Scale Discovery）多因子检测技术定量分析了IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等关键细胞因子的动态变化。此外，研究还运用了流式细胞术分析抗体处理后免疫细胞组成的变化，并采用了主成分分析（PCA）和均匀流形近似与投影（UMAP）等无监督降维方法对细胞因子谱和细胞表型数据进行可视化与模式识别。作为探索性分析，部分血浆样本还使用了Olink邻位延伸分析（PEA）技术进行了大规模的蛋白质组学（“分泌组”）分析，以发现更广泛的生物标志物。同时，研究还平行进行了体外细胞因子释放实验，比较了固相（SP）和液相（AQ）两种模式下，相同供体PBMC对参考抗体的反应，以建立体内外相关性。
3.1 HSC与PBMC植入的NSG小鼠中高效的免疫重建
研究首先证实了两种模型成功实现了人免疫细胞重建。HSC模型呈现出更全面的免疫重建谱系，早期以B细胞（CD20+ ）为主，后期T细胞（CD3+ ）稳定增长，并包含自然杀伤（NK）细胞等，其免疫细胞组成更接近健康人体。而PBMC模型则呈现T细胞主导的快速重建模式，B细胞和NK细胞植入水平很低。两种模型均观察到了供体间的变异性。
3.2 参考抗体库19/156在HSC与PBMC植入的人源化NSG小鼠中诱导了特征性的细胞因子模式
体内细胞因子分析揭示了不同抗体和不同模型的特异反应模式：
• 在HSC模型中，抗CD28-SA主要诱导了早期、显著的IL-2释放；抗CD3则引发了所有被检测细胞因子（IL-2, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α）的强烈且持续的释放；抗CD52则主要诱导了早期IL-2和TNF-α的短暂升高。
• 在PBMC模型中，抗CD3同样能诱导显著的细胞因子释放（IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α），但背景IFN-γ水平普遍较高，可能与移植物抗宿主病（GvHD）的早期迹象有关，这干扰了对治疗诱导的IFN-γ变化的检测。抗CD28-SA和抗CD52在该模型中的反应较弱。
• 主成分分析（PCA）进一步显示，HSC模型中的同型对照组样本变异较小，且与阳性抗体处理组的区分更明显，表明其背景噪音更低，可能更适合用于区分治疗相关效应。
3.3 HSC与PBMC植入的人源化NSG小鼠经参考抗体库19/156处理后的免疫细胞组成
流式细胞术分析显示，治疗后24小时：
• 抗CD28-SA处理未引起任何免疫细胞亚群的显著耗竭。
• 抗CD3处理在两个模型中均导致了T细胞（特别是CD4+ 和CD8+ 亚群）的显著耗竭。
• 抗CD52处理在HSC模型中导致了几乎所有评估的人免疫细胞亚群的广泛耗竭，与其已知的溶细胞特性一致；而在PBMC模型中，耗竭效应较弱且主要针对T细胞。
• 无监督聚类（UMAP）分析直观地展示了两种模型基线免疫组成的根本差异（HSC模型B细胞主导，PBMC模型T细胞主导），并证实了上述抗体处理引起的细胞组成变化。
3.4 对HSC或PBMC植入小鼠的分泌组分析揭示了共享和独特的分子特征
探索性蛋白质组学分析（Olink）在更广泛的层面揭示了抗体处理的分子特征。HSC模型对三种阳性抗体均产生了更多的差异表达蛋白（DEP）。不同抗体和不同模型诱导的DEP重叠有限，表明各自具有独特的分子签名。例如，在HSC模型中，抗CD3处理上调了包括IL-2, IL-10, TNF-α, IFN-γ在内的多种细胞因子/趋化因子；抗CD52处理则特异性上调了CCL3, CCL4, CCL20, CXCL8等趋化因子。该分析补充了靶向细胞因子检测的结果，提示了潜在的生物标志物。
3.5 用于NSG植入的供体PBMC对参考抗体库19/156的体外细胞因子释放反应
体外实验表明，抗体的呈现形式（固相SP vs. 液相AQ）强烈影响反应模式。只有固相呈现的抗CD28-SA能够诱导强烈的、包含IL-2在内的全面细胞因子风暴，这模拟了其临床反应所需的受体交联条件。抗CD3在两种模式下均能诱导强烈的细胞因子释放（除IL-2外）。抗CD52在固相下能诱导更强的反应。体外数据与体内数据对比，凸显了体内模型在模拟某些关键反应（如抗CD28-SA诱导的IL-2释放）上的价值，也揭示了其在复制其他反应（如强IFN-γ释放）方面的局限性。
在讨论 部分，作者深入阐释了本研究的意义。首先，研究系统地比较了两种常用人源化模型的优缺点：HSC模型能支持更全面的多谱系免疫重建，背景炎症低，对检测治疗相关信号更敏感，适合长期研究；而PBMC模型建立快速、T细胞丰富，但易受早期GvHD和背景炎症干扰，研究窗口期短。其次，研究验证了标准化参考抗体库（19/156）用于评估和“校准”不同临床前模型的实用价值。通过这把“标尺”，可以客观比较不同模型的敏感度和预测特性。研究还揭示了当前NSG模型在完全复制临床CRS反应（特别是抗CD28-SA所需的关键共刺激信号和特定T细胞亚群）方面存在局限性，指出了未来模型改进的方向，例如引入人类细胞因子转基因或使用更先进的免疫缺陷品系（如MHC I/II缺陷型）以改善免疫细胞功能、延长研究周期。
综上所述，本研究首次在体内平行评估了标准化抗体参考库在两种人源化小鼠模型中的表现，为这些模型在预测生物疗法免疫毒性方面的应用提供了关键基准数据。它强调了在临床前研究中纳入标准化参考材料，对于评估、验证和协调不同预测模型，最终提高体内外安全评估的可预测性 和可靠性 至关重要。这项工作朝着建立更稳健、更可翻译的免疫毒性评估体系迈出了重要一步，将为推动更安全、更有效的生物疗法的开发提供有力支持。
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