作者：Sedat Yumruk, Mukaddes Keskinates, Ziya Aydin, Bahar Yilmaz Altinok, Mevlut Bayrakci, Mustafa Keles
土耳其卡拉曼省卡拉曼诺卢梅赫梅特贝大学科学研究所生物工程系，邮编70200
摘要
草甘膦（Glyp）是最广泛使用的有机磷除草剂之一，被广泛用于控制入侵性杂草。然而，由于其可能对生态系统和人类健康造成的毒性，因此对草甘膦进行敏感且选择性的检测具有重要意义。本文合成了一种新型的二甲酰苯基化合物5-(叔丁基)-2-羟基-1,3-苯基)双(甲基亚甲基)双(1H-吡咯-2-碳酰肼)（S1），并研究了其对各种金属离子的选择性。实验结果表明，S1对Cu²⁺和Zn²⁺离子具有高选择性，能够形成相应的金属配合物（S1+Cu(II)和S1+Zn）。S1+Cu(II)配合物在与草甘膦相互作用时表现出明显的荧光“开启”响应，而S1+Zn配合物在同一条件下则表现出轻微的荧光“关闭”行为。在0–100 μM浓度范围内，草甘膦的荧光响应呈浓度依赖性，其检测限分别为3.0 nM（S1+Cu(II)）和5.0 nM（S1+Zn）。此外，使用S1+Cu(II)和S1+Zn对实际样品中的草甘膦进行定量分析，证明了这些配合物在实际应用中的巨大潜力。
引言
草甘膦（N-(膦甲基)甘氨酸）（Glyp）是全球应用最广泛的有机磷类除草剂之一，由于其广谱、系统性和高效性，被用于控制上百种杂草[1]、[2]、[3]、[4]。作为一种合成的高水溶性化合物，草甘膦含有四个酸性质子（pKa = 0.80, 2.22, 5.44, 10.13）[5]，能够容易地螯合二价金属离子，如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺和Fe²⁺。其中，Cu²⁺-Glyp配合物具有最高的热力学稳定性（log β = 11.9）[6]、[7]、[8]。草甘膦的除草活性源于其对植物芳香族氨基酸生物合成过程中所需的5-烯醇吡鲁夫酰基莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的抑制[9]。自从转基因抗草甘膦作物商业化以来，草甘膦的全球使用量大幅增加，导致其在土壤和水生生态系统中大量积累[10]、[11]。尽管草甘膦通常被认为是一种低毒性的除草剂，但人们对其环境持久性、生物累积潜力以及对人类健康的潜在不良影响越来越关注[12]、[13]、[14]。多项研究将草甘膦暴露与内分泌紊乱和细胞周期异常调控联系起来[15]。
草甘膦在环境中的广泛存在，以及关于其潜在健康影响的全球讨论，突显了快速、敏感和可靠的检测及定量方法的迫切需求。先进的色谱和质谱技术，包括GC–MS、LC–MS/MS和HPLC，提供了出色的灵敏度和可靠的定量准确性。然而，这些技术的应用通常伴随着高昂的设备成本、复杂的样品制备或衍生化程序以及高技能的操作人员要求，这些限制了它们的常规和广泛应用[16]、[17]、[18]。替代技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）[19]、[20]、安培法[21]、毛细管电泳[22]和比色法[23]、[24]、[25]、[26]，也已被广泛研究用于草甘膦的检测。然而，这些方法往往受到固有缺陷的限制，包括抗体不稳定性、传感器寿命短或痕量检测精度不足。在这种情况下，基于荧光的检测平台成为有吸引力的选择，因为它们结合了易用性、快速信号输出、可靠的检测能力和现场适用性。因此，已经成功设计了多种荧光探针，包括量子点（QD）[27]、[28]、纳米颗粒[29]、[30]和金属有机框架[31]，用于草甘膦的检测。最近的研究进一步表明，通过表面功能化和控制的金属-配体相互作用，纳米结构平台可以显著增强信号放大和降低检测限。基于量子点的探针具有高量子产率和可调的光学特性，而基于金属有机框架的系统则提供了结构多样性、高表面积以及双模式（荧光/比色）传感的可能性[32]。尽管这些荧光传感方法具有高灵敏度，但纳米结构传感平台往往涉及复杂的制备过程，并可能存在重现性和稳定性问题。在这些荧光传感方法中，基于金属的体系（如Cu²⁺和Zn²⁺）显示出明显优势，包括对草甘膦的强配位亲和力、良好的膜通透性和低毒性，使得Cu²⁺和Zn²⁺配合物成为选择性草甘膦传感的有希望的候选者[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]。此外，基于金属-指示剂复合物的荧光策略为实际应用提供了简单且低成本的替代方案。
最近的研究进一步展示了Cu²⁺介导的荧光探针在环境监测中的多功能性[41]、[42]。这些研究突显了对以Cu²⁺为中心的传感策略的兴趣，并强调了需要结构可调的系统，以实现简化设计和成本效益高的制造。与最近报道的探针相比，所提出的基于S1的传感系统具有结构简单的2,6-二甲酰-4-取代苯酚（DFP）衍生物框架、易于形成配合物和高效信号转导等优点，为草甘膦的检测提供了实用且具有竞争力的替代方案。
近年来，基于2,6-二甲酰-4-取代苯酚（DFP）的传感器（如2,6-二甲酰-4-甲基苯酚和4-叔丁基-2,6-二甲酰苯酚）已被广泛用于环境和生物样品中金属离子的纳摩尔级检测[43]、[44]。我们的研究小组此前开发了一系列对Cu²⁺和Zn²⁺离子具有高灵敏度的DFP基传感器[45]、[46]。在此基础上，预期这些传感器的相应Zn²⁺/Cu²⁺配合物在纳摩尔水平上对草甘膦的检测具有巨大潜力。受到已报道的铜和锌基传感系统的启发，并受到我们对农药检测持续兴趣的驱动[47]、[48]、[49]、[50]，我们设计并合成了一种新的DFP基荧光传感器5-(叔丁基)-2-羟基-1,3-苯基)双(甲基亚甲基)双(1H-吡咯-2-碳酰肼)（S1），用于选择性识别Zn²⁺和Cu²⁺离子。在确认其对Cu²⁺和Zn²⁺离子的响应性后，制备了相应的金属配合物（S1+Cu(II)和S1+Zn）。使用DMSO/HEPES缓冲液（10 mM, pH 7.4, v/v 1:1）中的荧光光谱和UV–Vis分光光度法研究了S1+Zn和S1+Cu(II)配合物的光学性质。这两种配合物在存在多种竞争性分析物的情况下，都对草甘膦表现出快速且高度选择性的荧光“开启”响应。此外，还进行了分光光度分析以评估S1+Cu(II)和S1+Zn配合物与草甘膦之间的相互作用，并通过FTIR和质谱实验阐明了传感机制。最后，测试了这些配合物在土壤样品和水中的实际应用能力。
材料与仪器
所有分析级别的试剂和溶剂均从商业渠道购买，直接用于实验而无需进一步处理。草甘膦购自Thermo Scientific。马拉硫磷、福美特、fenamiphos、glufosinate ammonium和dimethoate购自Sigma-Aldrich。所测试的金属盐来自Acros Organics和Sigma-Aldrich等商业供应商。
FT-IR光谱是在Bruker Vertex FT-IR光谱仪（ATR）上测量的。
S1的合成与表征
基于二甲酰苯基部分的荧光化学传感器的设计原理在于其含有多个电子供体位点，包括氮原子、氧原子和羰基。这些供体基团的协同作用使得与Cu²⁺和Zn²⁺等金属离子的有效配位成为可能[8]，从而形成高度稳定的配合物。草甘膦分子含有羧基、磷酸基和氨基官能团，这些官能团表现出强烈的结合能力
结论
在本研究中，成功合成了一种新型的基于二甲酰苯基的化学传感器S1，并对其对Cu²⁺和Zn²⁺离子进行了测试，形成了具有高选择性的S1+Cu(II)和S1+Zn配合物。S1+Cu(II)配合物在与草甘膦相互作用时表现出明显的荧光“开启”响应，而S1+Zn配合物在同一条件下表现出轻微的荧光“关闭”行为。在这两种情况下，都获得了良好的线性响应
环境影响
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作者贡献声明
AYDIN Ziya：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，资金获取，概念化。
Mukaddes Keskinates：验证，方法学，研究，数据分析。
Mevlut Bayrakci：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督。
Bahar Yilmaz Altinok：方法学，研究，数据分析。
Sedat Yumruk：方法学，研究，数据分析。
Mustafa Keles：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK，项目编号：124Z449）的支持。本文基于Sedat Yumruk的硕士论文完成。
