摘要
华风丹是一种用于治疗癫痫和神经退行性疾病的中药。先前的研究表明，它具有抗神经炎症、防止多巴胺能神经元丢失的作用，并能治疗缺血性中风，但其抗癫痫的疗效仍不明确。本研究的目的是探讨华风丹的抗癫痫效果及其保护机制。采用戊四唑（PTZ）诱导的小鼠点燃模型（35 mg/kg，每隔一天腹腔注射一次，共10次）来评估华风丹的抗癫痫效果。小鼠通过饲料摄入原始配方、减量配方和未发酵配方的华风丹，剂量为临床剂量（0.5 g/kg），并以地西泮作为阳性对照。每次PTZ注射后记录癫痫发作评分。实验结束后，收集大脑和结肠样本进行RNA-Seq和16S rRNA-Seq分析，并通过生物信息学和qPCR验证结果。结果表明，原始配方的华风丹对PTZ诱导的癫痫发作有效，而减量配方（0.25 g/kg）则无效。华风丹在不同程度上改善了PTZ引起的大脑异常基因表达。Ingenuity Pathway Analysis分析显示，PTZ改变的典型通路及其上游调控因子被华风丹处理后得到缓解。qPCR验证了早期即时基因、促炎介质、转运蛋白和凋亡基因的表达。华风丹还改善了PTZ破坏的肠道微生物群，其对Lachnospiraceae和ASV230的调节作用与文献结果一致。华风丹的抗癫痫效果似乎与调节大脑基因表达和肠道微生物群有关。
• 华风丹（HFD）配方对小鼠的PTZ诱导癫痫发作有效。
• 通过RNA测序（RNA-seq）显示，HFD改善了PTZ点燃小鼠的大脑异常基因表达。
• DEGs的IPA分析揭示了典型通路和上游调控因子的改善。
• 16S rRNA-seq显示HFD对PTZ点燃小鼠的微生物群有调节作用。
• qPCR验证了选定的大脑基因和细菌ASVs。
1. 引言
华风丹创建于1644年，因其“镇风”和抗惊厥特性而闻名于治疗多种脑部疾病，包括中风恢复、癫痫和面神经麻痹[1]。2004年，华风丹被中国知识产权局批准为治疗脑部疾病的传统药物，并获得了中国食品药品监督管理局的批准（GYZZ Z2002646）。原始华风丹配方包含多种草药、矿物质等成分（天麻（Gastrodia elata Bl.）、细叶薄荷（Nepeta tenuifolia）、印度楝（Croton tiglium L.）、 lancea黄芪（Atractylodes lancea (Thumb.) DC.）、巨型天南星（Typhonium giganteum Engl.）、香叶薄荷（Blumea balsamifera (L.) DC.）、tetarinowii菖蒲（Acorus tetarinowii Schott）、香薄荷（Perilla frutescens (L.) Britt）、Berezovskii麝香（Moschus berezovskii Flerov）、马滕斯蝎（Buthus martensii Karsch）、家蚕（Bombyx mori Linnaeus）、朱砂、雄黄和硼砂[1, 2]。这些植物名称已通过http://www.worldfloraonline.org（访问日期2025年9月15日）进行核对。出于安全考虑，朱砂和雄黄的用量从10%减少到3%，并称为“减量华风丹”[3, 4]。朱砂（α-HgS）在传统医学中已使用超过2000年，仍包含在56种中国药典配方中，包括著名的安宫牛黄丸，其中也含有10%的朱砂和雄黄[5]。朱砂是一种经典的镇静催眠药物，在许多抗惊厥配方中起关键作用[6]。然而，出于安全考虑，朱砂和雄黄的用量均减少到3%，并称为“减量华风丹”。通过GC–MS分析了华风丹中的44种挥发性和50种脂溶性成分[7]。最近的研究使用UPLC-Q-TOF-MS/MS检测到发酵和未发酵华风丹之间的51种不同成分[8]。华风丹中含有18%的发酵“Yaomu”，这对华风丹的药理作用至关重要[7–9]。“Yaomu”以原始形式添加，未经发酵，称为“未发酵华风丹”。完整的植物名称、批次编号和成分比例可以在最近的出版物中找到[8]。先前的研究表明，华风丹可以保护小鼠和大鼠免受帕金森病模型的影响[10, 3]。运动障碍与抗癫痫药物（如乙琥胺和丙戊酸）之间存在关联[11]，华风丹的抗癫痫效果是其主要临床应用之一。最近的一项临床研究表明，华风丹与丙戊酸钠联合使用对癫痫患者有效[12]。华风丹的临床应用与其实验基础之间存在差距，本研究旨在填补这一空白。在实验性癫痫动物模型中，戊四唑（PTZ）诱导的点燃模型是最广泛用于理解癫痫病理生理学的模型，癫痫被定义为一种涉及反复发作的慢性疾病[13]。与单次高剂量PTZ引起的急性发作相比，通过反复间歇性注射（通常10次）引起的慢性发作会导致更符合临床表现的强直-阵挛性发作[14]。PTZ点燃模型具有许多癫痫的临床特征，包括慢性反复发作和神经元损伤[15]，同时还会导致大脑中即时早期基因的异常表达[16]和肠道菌群失调[17]，常用于评估新型抗癫痫药物[17–20]。最近的研究还表明，华风丹对大鼠的脑缺血性中风有效[2]，此外还对帕金森病有效[3, 10]。这些研究表明，肠道微生物群的调节可能是华风丹的保护机制之一[2, 3, 10]。大脑-肠道-微生物群轴可能在华风丹的神经保护作用中起作用。我们之前的研究使用RNA-Seq发现了华风丹和“发酵Yaomu”对肝脏的有益效果[7]，对大脑的RNA-Seq分析有助于阐明其分子机制。在本研究中，使用PTZ点燃小鼠模型来探讨华风丹的抗癫痫效果，并测试华风丹的有益效果是否通过调节异常大脑基因表达和肠道菌群失调来介导的假设，地西泮作为阳性对照。由于地西泮是一种公认的抗焦虑药物，因此也研究了华风丹在无PTZ刺激的正常小鼠中的抗焦虑效果，作为其抗惊厥机制之一[21]。研究结果证明了华风丹的抗癫痫效果及其潜在机制。
2. 材料与方法
2.1 材料
华风丹原始配方（含10%朱砂和10%雄黄）、减量配方（含3%朱砂和3%雄黄）和未发酵配方（“Yaomu”未发酵3个月）由华风丹制药公司（中国遵义）提供。地西泮来自贵阳制药公司（中国贵阳），属于苯二氮卓类药物。PTZ来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。其他所有化学品均为试剂级。
2.2 动物和药物治疗
成年雄性昆明小鼠（20–22克）购自陆军医科大学实验动物中心（中国重庆）（证书编号SCXK, 2012-0011）。动物在遵义医科大学基础药理学重点实验室的SPF级设施中饲养，温度为20°C ± 2°C，光照时间为12小时/天，自由提供食物和饮用水。实验方案符合中国动物使用和福利指南，并获得了遵义医科大学机构动物护理和使用委员会的批准（ZMU21-2403-054）。
2.3 实验设计
适应一周后，根据先前描述的方法[3, 10]，通过饮食给予小鼠不同的华风丹配方。根据饲料消耗量，首次实验中原始配方、减量配方、未发酵配方和PTZ的剂量约为0.5 g/kg（n = 10）。在第二次实验（n = 8–9）中，添加了半量的减量配方（0.25 g/kg，n = 8），以评估剂量依赖性效果。华风丹配方在第一次PTZ注射前3天开始预处理，并持续到第10次PTZ注射（共20天），最后一次PTZ注射后30分钟对小鼠实施安乐死。对照组喂食普通啮齿动物饲料。所有饲料均由江苏Xietong Biology（中国南京）制备。PTZ用生理盐水新鲜配制，每隔一天腹腔注射一次，共10次[14]。与单次高剂量PTZ引起的急性发作不同，10次亚惊厥剂量注射会导致更符合临床表现的强直-阵挛性发作。PTZ点燃模型具有许多癫痫的临床特征，包括慢性反复发作和神经元损伤[15]，同时还会导致大脑中即时早期基因的异常表达[16]和肠道菌群失调[17]，常用于评估新型抗癫痫药物[17–20]。最近的研究还表明，华风丹对大鼠的脑缺血性中风有效[2]，以及对帕金森病的效果[3, 10]。这些研究表明，肠道微生物群的调节可能是其保护机制之一[2, 3, 10]。大脑-肠道-微生物群轴可能在华风丹的神经保护作用中起作用。我们之前的研究使用RNA-Seq发现了华风丹和“发酵Yaomu”对肝脏的有益效果[7]，对大脑的RNA-Seq分析有助于阐明其分子机制。在本研究中，使用PTZ点燃小鼠模型来探讨华风丹的抗癫痫效果，并测试华风丹的有益效果是否通过调节异常大脑基因表达和肠道菌群失调来介导的假设，地西泮作为阳性对照。由于地西泮是一种公认的抗焦虑药物，因此也研究了华风丹在无PTZ刺激的正常小鼠中的抗焦虑效果，作为其抗惊厥机制之一[21]。研究结果证明了华风丹的抗癫痫效果及其潜在机制。
2.4 脑RNA-Seq
大脑转录组分析按照先前描述的方法[22]进行。简要来说，使用RNAiso Plus（TaKaRa Bio Inc., 中国大连）按照制造商提供的说明提取总RNA。使用NanoDrop确定RNA的质量和数量。样本被送往上海Majorbio Bio-pharm Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）进行RNA质量验证、逆转录、文库构建和Illumina NovaSeq 6000平台测序。
2.5 生物信息学分析
所有RNA-Seq读数（57,000）导入Partek Flow（Qiagen, 美国马里兰州杰曼敦）进行分析。使用DESeq2方法在p < 0.05的标准下确定差异表达基因（DEGs）。DEGs经过二维、层次化链接生成Cdt文件，然后使用TreeView（版本1.6）进行可视化。DEGs还上传到Ingenuity Pathway Analysis（IPA）（Qiagen, 美国加利福尼亚州雷德伍德城）进行核心分析和比较分析。进行了典型通路和上游调控因子的分析。Z分数用于评估PTZ组与对照组以及PZT + 治疗组之间的变化。
2.6 微生物16S rRNA测序
收集新鲜结肠样本并储存在-80°C直至分析。根据制造商的说明，使用粪便DNA试剂盒（R1200；Solarbio, 中国北京）提取细菌DNA。使用NanoDrop ND-2000（Thermo Fisher Scientific Inc., 美国）测量DNA的质量和浓度，确保260/280 > 1.8，浓度>20 ng/μL。样本被送往上海Majorbio Bio-Pharm Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）进行质量检查和16S rRNA测序。Majorbio Cloud提供了一个一站式、全面的生物信息学平台用于多组学分析[23]。Illumina MiSeq fastq读数被导入QIIME2（微生物生态学定量分析）管道，优化数据使用DADA2方法进行处理。ASV（扩增子序列变异）代表序列和丰度信息，用于分析。使用Alpha多样性评估微生物群落的多样性，包括Chao、Shannon和Simpson指数。使用Beta多样性通过主坐标分析（PcoA）基于操作分类单元（OUT）水平可视化比较对照组和治疗组之间的细菌群落差异。
2.7 实时qPCR
使用PrimerScript RT试剂盒（TaKaRa Biotechnology Co., Ltd., 中国大连）将总RNA逆转录为cDNA。细菌DNA直接用于qPCR。引物由Primer3（版本4）设计，并由Sangon Biotech（中国上海）合成（表S1）。PCR反应按照先前描述的方法[22]进行，使用CFX 96实时荧光定量PCR仪器（Bio-Rad, Hercules, 美国加州）和iTaq Universal SYBR Green Supermix（Takara Bio, 日本）。相对基因表达水平使用每个样本的Gapdh进行归一化，并使用2−△△Ct公式计算。总细菌（Universal）作为细菌ASV表达的内参。
2.8 统计
PTZ诱导的癫痫发作评分使用单因素重复ANOVA和Shapira–Wilk正态性检验进行分析，随后进行Bonferroni t检验；RNA-seq和16S rRNA-Seq的DEGs和ASVs使用DESeq2进行分析；qPCR数据表示为平均值±SEM，并进行单因素ANOVA，随后进行Dunn's多重范围检验。p < 0.05被视为显著。
3. 结果
3.1 华风丹缓解了小鼠的PTZ诱导的点燃症状
PTZ是一种γ-氨基丁酸（GABA）A型（GABAA）受体拮抗剂，广泛用于产生癫痫点燃模型[13]。PTZ以亚惊厥剂量（35 mg/kg）慢性给药，每隔48小时注射一次，共10次，以达到完全点燃状态。实验中未出现死亡。每次PTZ注射后根据方法[14]中详细描述的标准评估癫痫发作评分。高脂肪饮食（HFD）配方（饲料中含量为0.25–0.5克/千克）和阳性药物地西泮（2毫克/千克，腹腔注射，在PTZ注射前30分钟）对PTZ癫痫发作评分的影响在第二次实验中被记录下来（图1）（在第一次实验中仅记录了10次PTZ注射后的完全癫痫发作评分）。图1在图查看器中打开
华风丹（Hua-Feng-Dan）对PTZ诱导的小鼠癫痫发作的影响。小鼠预先用不同的华风丹饮食（低剂量为0.5克/千克，高剂量为0.25克/千克）处理3天，然后每隔一天接受新鲜制备的PTZ（35毫克/千克，腹腔注射）共10次，小鼠在整个实验期间继续食用华风丹饮食。地西泮（2毫克/千克，口服）在每次PTZ注射前30分钟作为阳性对照。第二次实验中记录了PTZ注射后的癫痫发作评分[14]。数据为平均值±标准误（n = 8–9）。∗与PTZ组相比有显著差异，p < 0.05。在PTZ模型小鼠完全癫痫发作后（10次注射后），通过结合第一次和第二次实验的结果计算癫痫发作评分，使用单因素重复方差分析（one-way repeated ANOVA），随后进行Shapiro–Wilk正态性检验和Bonferroni t检验进行多组比较。与PTZ模型相比，地西泮非常有效，t值为13.382，其次是原始HFD（t值为11.564），Reduced_H（0.5克/千克，t值为7.214），而非发酵HFD（t值为7.118），而Reduced_L（0.25克/千克）无效（t值为0.342，p = 1.000）。此外，原始HFD比Reduced_H（t值为4.029，p < 0.003）和非发酵HFD（t值为4.265，p < 0.001）更有效，尽管所有配方在临床剂量（0.5克/千克）下都有效。表1. 华风丹对10次PTZ注射后癫痫发作评分的影响。组别
n
0级
1级
2级
3级
4级
5级
平均值
t与PTZ的比较
p
对照组
13
13
0
0
0
0
0
0.000
<0.001
PTZ模型
19
0
0
0
0
3
11
5
4.105
PTZ + 地西泮
16
2
9
2
3
0
0
1.375
13.382
<0.001
PTZ + 原始HFD
18
2
3
7
5
1
0
2.000
11.564
<0.001
PTZ + Reduced_L
8
0
0
1
4
3
0
3.250
0.342
1.000
PTZ + Reduced_H
17
2
2
3
5
3
2
2.647
7.214
<0.001
PTZ + 非发酵HFD
18
1
2
5
4
4
2
2.778
<0.001
注：数据结合了第一次（2023年）和第二次（2024年）实验（n = 8–19）。癫痫发作评分的标准详见方法部分，基于文献[14]中的标准。
3.2. DEGs的RNA-Seq分析
为了探索HFD对PTZ诱导的癫痫发作的保护机制，进行了脑部RNA-seq分析。RNA-seq产生了57,180个读段，这些读段被导入Partek Flow（Qiagen，Germantown，Maryland）进行分析。图2a显示了通过DESeq2分析得到的DEGs。根据p < 0.05的标准，PTZ模型组有251个基因上调，97个基因下调；PTZ_地西泮组有101个基因上调，137个基因下调；PTZ_原始组有280个基因上调，91个基因下调；PTZ_Reduced_L组有75个基因上调，60个基因下调；PTZ_Reduced_H组有138个基因上调，55个基因下调；PTZ_Nonfermented组有215个基因上调，57个基因下调。DEGs的层次聚类显示在图2b中。请注意，PTZ模型组中减少的42个基因（例如，Gm29394，−6.9，Oxt，−4.2，Cdhr1，−3.3）在治疗组中未出现（第一个箭头，第220–262行），而PTZ模型组中增加的75个基因（例如，Il17rc，4.2，Ptgs2，3.8，Mrm1，2.4）在治疗组中是正常的（第二个箭头，第677–752行）。2-D聚类基因在表S2中提供。图2（a）在图查看器中打开
RNA-seq分析。实验结束时收集了大脑样本，并提取总RNA用于RNA-seq分析（n = 4，第一次实验2个，第二次实验2个）。(a) p < 0.05下的差异表达基因（DEGs）；(b) DEGs的聚类热图。红色表示上调，蓝色表示下调。图2（b）在图查看器中打开
3.3. DEGs的IPA分析
IPA的前15个典型通路（图3a）显示，PTZ主要影响转录组（真核生物翻译起始、核糖体和rRNA加工以及蛋白质泛素化）、线粒体（氧化磷酸化、电子传递、线粒体功能障碍、复合物I生物合成）和细胞适应性反应（无义介导的衰变、中性粒细胞细胞外陷阱、颗粒酶A和EIF2信号传导、帕金森病信号传导和血肿消退），有12个通路上调和3个通路下调。PTZ模型组（第一列）的颜色强度在地西泮和HFD处理后不同程度地减弱。IPA的前15个上游调节因子（图3b）显示，PTZ影响多个信号通路（RICTOR/mTOR、sirolimus、CREB1和LARP1）、激素稳态（LH和NGF）、免疫功能（BCR、CD40和TCR）、癌基因（MYC和MYCN）以及细胞代谢和功能（CPT1B、MLXIPL、TEAD1和kainic酸），有11个通路上调和4个通路下调。同样，PTZ模型组（第一列）的颜色强度在地西泮和HFD配方处理后不同程度地减弱。图3（a）在图查看器中打开
Ingenuity通路分析（IPA）。(a) 基于Z分数的前15个典型通路。(b) 基于Z分数的前15个上游调节因子。红色表示上调，蓝色表示下调，与正常对照组相比。图3（b）在图查看器中打开
Ingenuity通路分析（IPA）。(a) 基于Z分数的前15个典型通路。(b) 基于Z分数的前15个上游调节因子。红色表示上调，蓝色表示下调，与正常对照组相比。PTZ模型与对照组之间的DEGs（p < 0.05）的IPA生成了图形摘要（图4）。在这个网络连接中，细胞稳态和MAPK1信号通路被炎症介质（IL-6、IL-1β）、免疫分子（IL-2、IL-3、IL-5、CD28和CD40）、生长因子（NGF、EGF、FGF2和CSF2）和功能分子（MYC和C3）激活，而RICTOR（mTORC2复合体的成员）信号通路和神经保护分子CPE（羧肽酶E）[24]则减弱。图4在图查看器中打开
Ingenuity通路分析（IPA）显示了PTZ与正常对照组相比的主要分子变化。橙色表示上调，蓝色表示下调。节点的形状表示主要分子或生物学效应。
3.4. qRT-PCR分析
根据PTZ模型的图形摘要和关于PTZ诱导的DEGs的文献，选择了以下基因类别进行qPCR分析：(1) 炎症[25]，(2) BDNF/TrkB通路[26]，(3) GABA转运蛋白和Trpm2离子通道[26, 27]以及与凋亡相关的Parp1和Bnip3[28]。图5显示了这些基因在PTZ诱导的癫痫发作小鼠中的上调，所有这些基因都通过地西泮和原始HFD得到了减弱。Reduced HFD也对Tnfα、TrkB、Bdnf和Slc6a1有效，而非发酵HFD对TrkB、Bdnf和Slc6a1也有效。Reduced HFD的半剂量也对Tnfα、TrkB、Bdnf和Slc6a1有效。图5在图查看器中打开
对选定的即时早期基因进行了qPCR分析。第一次实验的总RNA（n = 8）进行了qPCR验证。数据为平均值±标准误，∗PTZ与对照组相比，p < 0.05；#处理与PTZ相比，p < 0.05。根据图2中显示的DEGs的层次聚类，选择了八个即时早期基因[16]进行qPCR验证（图6）。正如预期的那样，慢性PTZ诱导的癫痫发作增加了即时早期基因Fos、FosB、Ptgs2、Egr1、Gadd45g、Btg2和Arc的表达。所有这些基因都通过地西泮和原始HFD显著减弱，其中一些基因也通过Reduced和nonfermented HFD得到缓解（Fos、FosB、Egr1、Gadd45g、Btg2和Arc），而Reduced HFD的半剂量（0.25克/千克）的效果较差。图6在图查看器中打开
对第一次和第二次实验的总RNA（n = 10）进行了qPCR验证。数据为平均值±标准误，∗PTZ与对照组相比，p < 0.05；#处理与PTZ相比，p < 0.05。
3.5. HFD对PTZ诱导癫痫发作小鼠肠道微生物组组成的影响
新兴证据表明，肠道微生物群-大脑轴与大脑疾病（包括癫痫[29]）密切相关。肠道微生物群的调节介导了药物在PTZ诱导的癫痫发作模型中的抗癫痫作用[19]。肠道微生物组的组成、α多样性和β多样性是评估药物在PTZ诱导的癫痫发作模型中效果的重要参数[18]。已经证明HFD通过调节LPS加MPTP模型小鼠[10]、LPS加罗通纳处理的大鼠[3]以及大脑中动脉阻塞（MACO）大鼠[2]的肠道微生物组来发挥神经保护作用，研究了HFD配方的抗癫痫作用是否通过调节肠道微生物群来实现。在本研究中，15960个ASV读段属于15个门类，前8个门类在图7a中展示，Bacteroidota（B）/Firmicutes（F）的比例在不同组间有所变化（分别为1.38、1.29、1.11和1.69），但这些变化没有统计学意义。选择了前20个家族制作热图（图7b）进行比较。然而，α多样性和β多样性没有显著变化。图7（a）在图查看器中打开
从结肠内容物中分离出细菌DNA，并进行了16S rRNA-seq分析（n = 4）（第二次实验）。(a) 主要门类水平的微生物组组成；(b) 家族水平的组成，颜色强度表示丰度。图7（b）在图查看器中打开
从结肠内容物中分离出细菌DNA，并进行了16S rRNA-seq分析（n = 4）（第二次实验）。(a) 主要门类水平的微生物组组成；(b) 家族水平的组成，颜色强度表示丰度。ASV可以检测细菌DNA的变化。进一步使用qPCR分析了选定的4个ASV（图8）。PTZ增加了ASV230，减少了ASV37和ASV140和ASV117。地西泮和HFD可以在不同程度上改善这种微生物组紊乱。即使是非发酵HFD也能逆转PTZ减少的ASV140和ASV117，但Reduced_Low的半剂量与PTZ模型相比效果不佳。图8在图查看器中打开
对选定的ASV进行了qPCR验证。使用特定引物对选定的ASV进行了qPCR（表S1）。数据为平均值±标准误（n = 8），来自第二次实验。∗PTZ与对照组相比，p < 0.05；#处理与PTZ相比，p < 0.05。
4. 讨论
本研究清楚地证明了HFD在PTZ诱导的癫痫发作小鼠模型中的抗癫痫作用。原始HFD、Reduced HFD和非发酵HFD配方都对癫痫发作有效，其中原始HFD效果最好，而Reduced HFD的半剂量无效。脑部RNA-seq揭示了各组之间的DEGs，DEGs的IPA揭示了PTZ改变的典型通路和上游调节因子，这些通过HFD处理得到了改善。qPCR验证了RNA-seq的结果，PTZ增加了即时早期基因的表达，炎症介质、转运蛋白和凋亡基因通过地西泮和HFD配方在不同程度上得到减弱；通过16S rRNA-seq进行的肠道微生物组分析显示，PTZ诱导的菌群失调可以通过HFD处理得到改善。本研究填补了HFD在临床应用对抗癫痫与药理学基础之间的空白。PTZ是一种GABAA受体拮抗剂，PTZ诱导的癫痫发作小鼠模型广泛用于模拟癫痫患者的慢性、反复性癫痫发作[13, 14]。PTZ诱导的癫痫发作非常适合评估传统药物的抗癫痫作用[17, 19]。第二次实验记录了PTZ诱导的癫痫发作的时间过程，并与第一次实验结合，在10次PTZ注射后的完全癫痫发作阶段进行了统计分析（表1）。与PTZ模型相比，Bonferroni t检验值分别为地西泮13.382、原始HFD 11.564、Reduced HFD 7.214和非发酵HFD 7.118，表明HFD配方在治疗癫痫方面具有治疗效果。然而，原始HFD比Reduced HFD和非发酵HFD更有效，表明朱砂和“Yaomu”发酵对PTZ诱导的癫痫发作有作用。朱砂以其镇静和抗惊厥作用而闻名[5, 6]。最近的研究发现，朱砂在安宫牛黄丸中对对抗缺血性休克的治疗效果至关重要[30]；同样，在上和解固片中，朱砂也是减少马钱子种子神经毒性的必要成分[31]。朱砂不仅是一种重要的矿物药物，具有镇静和抗惊厥作用，还可以作为多功能递送系统中的纳米载体[32]。尽管原始配方和改良配方的高脂饮食（HFD）都对PTZ诱导的慢性癫痫发作有效，但在本研究中原始配方效果更好，这与其在正常小鼠中的抗焦虑作用一致。事实上，从HFD配方中减少或去除朱砂会削弱其抗神经炎症作用[3, 4]，并减弱其对肠道微生物群的调节作用[3]。关于原始HFD配方中是否需要包含10%的朱砂，仍需进一步澄清和研究。脑部RNA测序揭示了PTZ诱导的差异表达基因（DEGs），这些基因在应用地西泮和HFD治疗后得到了改善，这一点通过2D层次聚类分析得到了验证。这些DEGs随后被上传到IPA进行生物信息学分析。典型途径（图3a）、上游调节因子（图3b）以及PTZ诱导变化的图形总结（图4）揭示了PTZ诱导的小鼠大脑中的分子事件以及HFD的治疗效果。值得注意的是，HFD对PTZ诱导的改变具有与地西泮相同方向的缓解作用，尽管程度不同。在典型途径中，转录组调控、线粒体功能、炎症信号传导、适应性反应和修复机制占据了主导地位。上游调节因子中，RICTOR、CPT1B、LARP1和西罗莫司的上调表明mTOR/Akt和代谢发生了改变；LH、CREB1、MLXIPL、NGF和TEAD1的下调表明激素稳态受到破坏；BCR、TCR复合物、CD40、MYC和MYCN的下调表明免疫调节和细胞止血功能受损。图形总结显示，HFD在缓解PTZ诱导的变化方面与地西泮作用方向一致，但程度不同。在典型途径中，转录组调控、线粒体功能、炎症信号传导、适应性反应和修复机制尤为突出。上游调节因子中，RICTOR、CPT1B、LARP1和西罗莫司的上调表明mTOR/Akt和代谢发生了改变；LH、CREB1、MLXIPL、NGF和TEAD1的下调表明激素稳态受到破坏；BCR、TCR复合物、CD40、MYC和MYCN的下调表明免疫调节和细胞止血功能受损。RNA测序分析还揭示了PTZ诱导的大鼠癫痫中的几个关键基因和信号通路，包括抗凋亡机制，如抗惊厥剂Q808的作用[33]。KEGG和IPA分析都提供了潜在的重要分子事件。有趣的是，在我们对正常小鼠的后续研究中，HFD和地西泮处理的DEGs分析显示的通路变化与PTZ诱导的癫痫发作相反[21]，这进一步证实了HFD的有益效果。与图形网络总结（图4）一致，PTZ诱导的小鼠表现出促炎标志物的增加[25, 26]、BDNF/TrkB通路[26, 34]、GABA转运蛋白和离子通道[26, 27]以及与凋亡相关的基因[28]的表达增加。正如预期的那样，HFD和地西泮都以不同的程度减轻了PTZ诱导的变化。在典型途径中，转录组调控、线粒体功能、炎症信号传导、适应性反应和修复机制占主导地位。上游调节因子中，RICTOR、CPT1B、LARP1和西罗莫司的上调表明mTOR/Akt和代谢发生了改变；LH、CREB1、MLXIPL、NGF和TEAD1的下调表明激素稳态受到破坏；BCR、TCR复合物、CD40、MYC和MYCN的下调表明免疫调节和细胞止血功能受损。图形总结显示，HFD在缓解炎症反应、生长因子、mTORC2代谢以及CPE等神经保护分子方面发挥了作用[24]。通过GO和KEGG富集分析，PTZ诱导的大鼠癫痫揭示了几个关键基因和信号通路，包括抗凋亡机制，如抗惊厥剂Q808的作用[33]。KEGG和IPA分析都提供了潜在的重要分子事件。有趣的是，在我们对正常小鼠的后续研究中，HFD和地西泮处理的DEGs分析显示的通路变化与PTZ诱导的癫痫发作相反[21]，这进一步证实了HFD的有益效果。与图形网络总结（图4）一致，PTZ诱导的小鼠表现出促炎标志物的增加[25, 26]、BDNF/TrkB通路[26, 34]、GABA转运蛋白和离子通道[26, 27]以及与凋亡相关的基因[28]的表达增加。正如预期的那样，地西泮和HFD配方降低了炎症标志物TNFα和NF-κB的表达，PTZ上调的TrkB和Bdnf以及GABA转运蛋白Slc6a1（GAT-1）和离子通道Trpm2的表达也得到了降低。PTZ诱导的凋亡相关基因parp1和Bnip3的表达也得到了降低，这与抗惊厥效果一致。在PTZ诱导的模型中，经常观察到“即时早期基因”如Fos、FosB[16, 35]、Ptg2、Egr1[36, 37]、Gadd45g、Btg、Arc和Nr4a1[38, 39]的表达增加，这在RNA-Seq和qRT-PCR分析中也得到了证实。这些基因的表达在地西泮和原始HFD处理后显著降低，在改良配方和非发酵配方中降低或趋于降低，但在半剂量改良配方中的效果较差。微生物群-肠道-大脑轴在癫痫的发病机制中起着重要作用[29]。在PTZ诱导的模型中，地西泮通过调节肠道微生物群组成和α多样性发挥抗癫痫作用[18]；碳酸酐酶抑制剂托吡酯与Lactobacillus johnsonii一起使用可降低PTZ诱导的癫痫发作易感性[40]；Diosgenin在PTZ诱导的小鼠中的抗癫痫作用也是通过肠道微生物群介导的[19]；而抗生素混合物导致的肠道微生物群缺失则消除了罗勒油的抗惊厥作用，并增加了F/bacteroidetes的比例[17]。在本研究中，这些处理对肠道微生物群的门和科水平略有影响，PTZ引起的四种选定ASVs的紊乱在地西泮和HFD的作用下得到了不同程度的改善。HFD对Lachnospiraceae的调节也参与了其对脑缺血性中风的保护作用[2]，PTZ增加的ASV230在PTZ诱导的小鼠和正常小鼠中也得到了HFD的降低[21]。总体而言，这些数据表明肠道微生物群的调节可能是HFD保护作用的一种机制。非发酵配方在PTZ诱导的小鼠中也表现出抗惊厥效果，并且在正常小鼠中还表现出一定的抗焦虑作用，尽管效果不如原始和改良配方，这表明“发酵”是HFD制备的重要过程。对非发酵HFD和“药木”进行了化学成分分析[8, 9]，发现了发酵和非发酵HFD之间的51个差异成分[8]。还应注意的是，“药木”的发酵不仅影响肝脏基因表达[7]，还可以增强HFD在治疗缺血性中风中的有益效果[8]，这与本研究中观察到的更好的抗癫痫效果一致。还应指出，原始和改良HFD在急性和慢性毒性研究[1]以及药理学研究[2, 7, 8]中都是安全的，无论是通过饲料还是含有药物的饲料[3, 10]。还应注意的是，配方中的其他草药或成分可以保护朱砂的毒性，例如安宫牛黄丸[41, 42]、朱砂安生丸[43]等。事实上，根据《中国药典》的记载，许多配方含有大量的朱砂，如 Shayao（11%）、小儿金丹片（12%）、小儿惊风散（12%）、九方止保散（12%）、牛黄强筋散（17%）、ZSASW（24%）、红灵散（24%）和碧文散（44%）[5]。然而，应谨慎使用这些含有朱砂和雄黄的传统药物，以避免长期使用，并权衡其利弊。本研究存在一些局限性：首先，仅使用了雄性小鼠；未来的研究将考虑使用雌性动物；其次，需要进一步研究HFD中负责抗癫痫作用的具体生物活性分子。
5. 结论
本研究证明，HFD配方对PTZ诱导的小鼠癫痫发作有效，可能是通过抑制PTZ诱导的脑基因表达和调节PTZ诱导的肠道微生物群失调来实现的，为其在临床治疗癫痫提供了药理学依据。
作者贡献
金莉和刘杰构思并设计了这项研究。李文凯进行了主要实验并准备了手稿初稿。金莉、李文凯、刘波和徐尚福参与了数据整理、分析、验证和可视化工作。徐尚福、金莉和史静山提供了资源、资金获取和管理支持。所有作者都审阅并编辑了手稿。
致谢
作者感谢邹燕教授在统计分析方面的帮助，以及赵薇女士和张萌女士在动物处理方面的协助。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82360859、82460879、U1812403、82560832）的支持。
伦理声明
实验方案遵循了中国动物使用和福利指南，并获得了遵义医科大学动物护理和使用委员会的批准（ZMU21-2403-054）。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
本研究生成的RNA-seq和16S rRNA-seq数据可公开获取。数据链接为：https://zenodo.org/records/14913055，版本1。更多支持信息可在支持信息部分找到。
