一种基于吡咯喹啉的荧光探针，用于活细胞和斑马鱼模型中超氧阴离子的选择性成像

时间：2026年4月21日

来源：Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry

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超氧阴离子检测荧光探针PQSP的合成与应用研究。基于吡咯喹啉scaffold的小分子荧光探针PQSP实现超氧阴离子的高灵敏度检测，检测限0.35 μM，荧光量子产率0.48。该探针在活体HepG2细胞和斑马鱼胚胎中成功实时监测超氧阴离子水平，并具备炎症条件下检测能力。

南通大学化学与化学工程学院，中国南通226019

摘要

超氧阴离子（O₂^•-）在细胞信号传导和功能中起着关键作用，但由于其浓度低、半衰期短且反应性强，在体内检测仍然具有挑战性，这促使人们需要开发出灵敏、选择性强的实时分析方法。在这项研究中，我们报道了一种基于吡咯喹啉骨架的小分子荧光探针PQSP，用于检测O₂^•-。光谱分析表明，该探针对O₂^•-具有快速且选择性的响应，且不会受到常见氨基酸、阳离子、阴离子或其他活性氧物质的显著干扰。经过细胞毒性评估后，PQSP成功应用于活HepG2细胞和3天大的斑马鱼幼体中O₂^•-水平的实时监测。此外，PQSP还显示出能够检测炎症条件下产生的O₂^•-。这项工作为研究氧化应激相关的病理生理学及开发相关诊断方法提供了一种有前景的分子工具。

引言

超氧阴离子（O₂^•-），通常被称为超氧阴离子自由基，是一种通过分子氧的单价还原产生的活性氧（ROS）。在生物系统中，它主要通过线粒体电子传递链（ETC）或膜相关NADPH氧化酶（Nox）产生[1]，[2]。作为细胞氧代谢过程中形成的最初以氧为中心的自由基，O₂^•-在自由基介导的链反应中起着关键作用，导致其他ROS的生成，包括羟基自由基（•OH）、单线态氧（¹O₂）和过氧化氢（H₂O₂）。O₂^•-与细胞内的抗氧化系统（主要是超氧化物歧化酶（SOD）相互作用，调节细胞的基本过程，如增殖、损伤反应和细胞死亡，从而对细胞信号通路产生广泛影响[3]。在稳态条件下，O₂^•-的水平受到严格调控，维持多种生理功能。这些功能包括通过增强吞噬活性来介导抗菌免疫、促进衰老和异常细胞的清除、促进甲状腺激素、前列腺素和凝血酶原的合成，以及支持药物和外源化合物的代谢解毒。然而，在病理条件下，O₂^•-的产生增加和/或清除能力下降会破坏氧化还原平衡，引发持续的氧化应激，并导致多种疾病的发展，如癌症[4]、心血管和脑血管疾病[5]、阿尔茨海默病[6]、神经系统疾病[7]、抑郁症[8]以及与衰老相关的病理变化[9]。

O₂^•-的固有物理化学特性，特别是其低基础浓度、短暂寿命和强氧化还原活性，为开发能够在原位进行高灵敏度和分子特异性实时监测的分析平台带来了重大挑战。这一持续的技术难题使得O₂^•-的检测成为活性氧研究中的一个持续关注点。传统的检测技术，如电子自旋共振（ESR）[10]、光谱法[11]、高效液相色谱（HPLC）[12]、质谱法[13]、电化学方法[14]和化学发光测定[15]，存在许多局限性，包括处理时间较长、仪器成本较高、选择性一般、经常需要催化放大，以及通常需要进行组织匀浆和体外分析。相比之下，小分子荧光探针具有显著的优势，包括出色的生物相容性、高效的细胞渗透性、优越的时空分辨率、极高的检测灵敏度和简单的实施方法[16]。自2004年首次报道以来[17]，已经系统地开发了许多针对O₂^•-的特异性荧光分子探针，极大地扩展了研究这种关键活性氧生物功能的方法工具箱。

现代用于O₂^•-检测的有机小分子荧光探针的设计主要围绕两种基本传感机制[18]。第一种方法基于亲核加成引发的脱保护策略。在这种策略中，O₂^•-选择性地与特定的保护基团（如磷酸酯[19]、[20]、[21]或三氟甲磺酸基团[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]）反应，这些基团被战略性地结合到分子结构中。这种反应通过去除保护基团来释放荧光团，并伴随荧光的恢复或增强[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。第二种机制利用O₂^•-的氧化能力来调节探针结构内的电荷转移。氧化对氧化还原敏感的功能基团（如苯并噻唑[31]、[32]、[33]、邻二苯醌[34]、硒代砜单元[35]和N-取代的Schiff碱盐[36]）会重新组织荧光团系统内的电子密度分布，从而产生可量化的荧光强度增强[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。

在这里，我们基于上述第二种氧化还原识别机制开发了一种基于吡咯喹啉骨架的小分子荧光探针PQSP。先前的研究表明，固定在电极表面的PQSP分子在电化学检测H₂O₂时表现出显著的电催化活性[37]。此外，PQSP还被锚定在银腔阵列（SCA）上作为H₂O₂响应部分，构建了一种新型的表面增强拉曼散射（SERS）传感器[38]，能够灵敏且选择性地检测H₂O₂相关的代谢物。受这些发现的启发，我们应用PQSP作为小分子荧光探针来检测超氧阴离子。有两个关键区别值得强调：首先，这项工作实现了通过PQSP小分子进行原位和实时的超氧阴离子检测，这与之前依赖底物固定系统的过氧化氢检测方法有根本不同；其次，所使用的荧光基团不是之前报道的蓝色荧光吡咯喹啉骨架[39]、[40]，而是通过分析物识别扩展π共轭系统，从而诱导发射波长的红移。实验验证确认，通过吡咯喹啉与苯并噻唑的共轭形成的加合物（即识别产物）在较长的发射波长下表现出绿色荧光（图1）。

材料与设备

所有分析级化学品均来自商业渠道，使用前无需进一步纯化。柱色谱使用硅胶（200–300目）进行。熔点是在SGW X-4B微熔点仪器（上海，中国）上测得的，报告时未进行校正。

¹H和¹³C核磁共振（NMR）谱是在Bruker AVANCE III HD 400 MHz光谱仪上获得的，以四甲基硅烷（TMS）作为内标。化学位移（δ）以百万分之一（ppm）为单位表示

探针PQSP

的合成

喹啉核心通过Conrad-Limpach环缩合高效构建，得到中间体PQ-1。随后对PQ-1进行区域选择性Vilsmeier-Haack反应，得到甲酰基化的中间体PQ-2。将PQ-2与2-氨基茴香酚缩合得到目标荧光探针PQSP。PQSP的完整合成过程详见方案2，其化学结构通过NMR光谱和HRMS谱验证（图S1-S3）。

探针PQSP

对O₂^•-的光谱响应

首先，如图所示

结论

总之，我们开发了一种基于吡咯喹啉的新型荧光探针（PQSP），用于选择性和快速检测O₂^•-。当暴露于O₂^•-时，PQSP会表现出明显的荧光变化，并在广泛的pH范围内保持性能。对于PQSP，检测限量为0.35 μM，分析物结合后的荧光量子产率为0.48。通过理论计算和高分辨率质谱阐明了其传感机制

CRediT作者贡献声明

Jia-Hua Zhou：方法学、研究。Juan Tang：可视化、验证。Cheng-Jin Qin：可视化。Fa Wang：方法学。Wen-Qing Li：可视化。Meng-Ya Guo：可视化。Ruo-Jun Man：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、资金获取。Yun-Sheng Xue：验证、软件、研究。Hai-Liang Zhu：监督、概念化。Bing Yang：撰写 – 初稿、方法学、研究、资金获取。