摘要：糖萼是覆盖人体所有细胞的一层复杂的糖基化分子。它参与调节关键的细胞过程，包括免疫反应调节、细胞黏附以及宿主-病原体相互作用。尽管有这些认识，但由于糖萼成分的结构多样性和它们的纳米级组织方式，糖萼结构与细胞状态之间的功能关系仍然难以捉摸。在这里，我们展示了通过DNA标记的凝集素标记和代谢寡糖工程技术，可以对糖萼成分进行多重超分辨率显微镜观察，从而获得具有纳米级分辨率的糖萼结构图谱。对获得的糖萼成分纳米级图谱的定量分析有助于提取能够准确反映细胞状态的特征性空间关系。我们证明了这种方法（我们称之为“糖链图谱构建”）在从培养细胞系到原代免疫细胞、神经元以及原代患者组织等多种细胞和组织类型中的适用性。糖链图谱构建为研究发育和疾病过程中的糖萼重塑提供了一种变革性策略，有可能促进以糖萼为中心的诊断和治疗靶点的开发。
糖萼是一层密集的、动态的糖基化分子层，覆盖所有哺乳动物细胞，使其成为细胞与外部环境相互作用的第一部分（图1a）。研究表明，糖萼参与了多种细胞过程，包括但不限于免疫反应调节、囊胚黏附和宿主-病原体相互作用。
在过去几十年中，研究揭示了糖萼在细胞生物学中的许多功能作用。例如，已证明唾液酸化配体与免疫细胞Siglec之间的相互作用可以降低免疫细胞活性；在致癌事件中观察到糖萼厚度增加；并且研究了糖基化改变与转移之间的相互作用。从结构角度来看，糖萼的关键成分是由葡萄糖、半乳糖和唾液酸等单糖组成的糖链。由于糖链在大小、分子组成和立体化学性质上的多样性，糖萼内部的结构多样性非常丰富。糖萼高度复杂的结构组织与其在健康和疾病中的生物学功能之间的关系似乎是存在的，但迄今为止尚未完全理解。分析方法（如质谱法）对于识别糖链结构非常有效，但无法推断其天然的空间排列细节。质谱成像通过将糖链从天然细胞环境中离子化部分解决了这一缺点；然而，其分辨率不允许进行亚细胞甚至分子级别的分析。此外，电子显微镜也被用来研究糖萼，尽管它提供了高分辨率，但人们担心其样品制备程序可能会损害糖萼的天然结构。此外，电子显微镜仅产生电子密度的灰度图像，缺乏区分分子成分所需的物种特异性对比度。光学显微镜被认为相对无创，并提供物种对比度，但由于糖萼的纳米级结构，其分辨率受到衍射限制，约为250纳米。随着超分辨率显微镜方法的出现，这种情况发生了改变。特别是单分子超分辨率显微镜技术依赖于荧光团发射的时间分离，这种方法首次实现了在衍射长度以下尺度上对糖萼成分的分析。最近的研究使用多重dSTORM技术分析了不同细胞器中糖链的相对丰度，尽管没有将这些读数与细胞状态联系起来。此外，还通过对糖萼成分进行染色来分析扩散指标，以从细胞表面糖链的运动中提取细胞参数。这是一种研究细胞系上糖链运动的方法；然而，它主要关注追踪，未能揭示糖萼成分的组织结构，因此未能建立糖萼空间结构与细胞状态之间的联系。因此，尽管取得了进展，但尚未实现对糖萼组织及其与细胞状态之间关系的全面量化。
在这里，我们提出了“糖链图谱构建”方法，这是一种对细胞表面糖链结构进行定量映射的技术，揭示了糖萼纳米级组织与细胞状态之间的相互作用。我们使用凝集素标记结合非天然糖的代谢掺入，用优化用于高速多重超分辨率显微镜的DNA序列来标记不同的糖萼成分。随后通过定制的流程分析获得的定位数据，提取糖链部分内的特征性空间关系（使用GlycanConstructor26（GlyCo）软件包）。通过这种方法，我们实现了对多种样本类型（从培养细胞系到原代免疫细胞、神经元和患者组织）的糖萼超分辨率图谱的构建，将糖萼的纳米级组织与细胞状态联系起来。
糖链图谱构建的核心是使用DNA点积累进行纳米级地形成像（DNA-PAINT），通过DNA编码的凝集素进行标记，并结合代谢寡糖工程（图1b）。这种综合方法促进了糖萼成分的超分辨率成像。选择合适的凝集素是基于之前研究凝集素性能指标的结果。因此，我们获得了市场上可用凝集素的全面概述，包括它们的结合特异性、亲和力和相互兼容性。在初步筛选数据库后，根据进一步实验研究的文献进行了改进。最终，我们确定了以下凝集素：小麦胚芽凝集素（WGA）结合唾液酸和N-乙酰葡糖胺，这些在癌细胞中上调，促进免疫逃逸和转移；黑接骨木凝集素（SNA）识别α-2,6连接的唾液酸，这种修饰与肿瘤侵袭性和免疫调节相关；菜豆白凝集素（PHA-L）检测β1-6分支的N-糖链，这是恶性转化的标志，增强了肿瘤侵袭性；橙色毛壳菌凝集素（AAL）结合岩藻糖连接的（α-1,3, α-1,2, α-4和α-1,6）N-乙酰乳糖胺，这些在免疫识别和炎症过程中起作用；豌豆凝集素（PSA）靶向α-岩藻糖残基，参与病原体识别和免疫信号传导。凝集素浓度经过优化以确保全面标记（补充图1a–e），控制实验验证了凝集素对玻璃盖片的亲和力可以忽略不计（补充图1f）。
同时，通过将N-叠氮乙酰甘露胺（Ac4ManNAz）掺入细胞表面的唾液酸残基来应用代谢寡糖工程。代谢标记的唾液酸通过无铜点击化学与DNA编码的二苯并环辛炔（DBCO）结合。这种菌株促进的叠氮-炔环加成反应在生理条件下迅速进行，形成稳定的三唑连接，无需潜在的细胞毒性铜催化。此外，在没有叠氮基团的情况下，DBCO-DNA的非特异性结合最小。这种策略也与使用部分O-酰基化非天然叠氮糖的下一代代谢标记方法兼容。
由于糖萼的结构复杂性，通过超分辨率研究其结构获得的数据本质上很复杂。为了破译这种复杂性，仅仅视觉检查重建结果是不够的。因此，糖链图谱构建使用定量分析细胞表面糖链种类之间的纳米级空间关系。首先顺序捕获每个成像目标的原始定位数据，然后对这些定位数据进行漂移校正和对齐。接下来，从分析中排除任何非细胞信号，对感兴趣的区域进行分割，排除由成像链和单个对接链重复相互作用产生的多个定位。将簇中心作为目标位置，我们将其称为“凝集素结合位点”。随后使用最近邻（NN）峰距离矩阵和GlyCo对目标位置进行定量分析（图1c,d），然后通过主成分分析（PCA）进行降维。补充图2显示了糖链图谱构建的关键步骤。NN分析用于揭示凝集素结合位点在空间分布中的全局模式，无需进一步假设。尽管NN分析对糖链的生化性质不了解，但GlyCo框架考虑了先前研究中已知的糖链的典型长度尺度。如果凝集素结合位点的距离在5纳米半径范围内，则将它们分组，假设在这个阈值或以下，它们属于同一糖链。这有助于重建整个糖链（亚）结构。无论哪种情况，基于NN和GlyCo的分析都能追踪纳米级糖链组织如何反映不同的细胞状态，从而提供生物学上相关且可解释的空间数据。
糖链图谱构建在一系列复杂度逐渐增加的相关样本类型中得到了验证，确保在转移到更复杂的样本之前，在受控环境中进行了基准测试。研究的不同系统在图2a中以示意图形式表示。我们首先使用标准培养细胞系（图2b），然后是原代大鼠神经元（图2c）、人原代免疫细胞（图2d），最后是原代人组织（图2e）。每个样本都使用相同的协议进行标记和分析，仅根据所研究系统的具体要求进行了轻微调整（方法部分）。更多示例见补充图3。
糖链图谱构建主要使用DNA点积累进行纳米级地形成像（DNA-PAINT），通过DNA编码的凝集素标记和代谢寡糖工程（图1b）。这种综合方法促进了糖萼成分的超分辨率成像。选择合适的凝集素是基于之前研究凝集素性能指标的结果。因此，我们获得了市场上可用凝集素的全面概述，包括它们的结合特异性、亲和力和相互兼容性。在初步筛选数据库后，根据进一步实验研究的文献进行了改进。最终，我们确定了以下凝集素：小麦胚芽凝集素（WGA）结合唾液酸和N-乙酰葡糖胺，这些在癌细胞中上调，促进免疫逃逸和转移；黑接骨木凝集素（SNA）识别α-2,6连接的唾液酸，这种修饰与肿瘤侵袭性和免疫调节相关；菜豆白凝集素（PHA-L）检测β1-6分支的N-糖链，这是恶性转化的标志，增强了肿瘤侵袭性；橙色毛壳菌凝集素（AAL）结合岩藻糖连接的（α-1,3, α-1,2, α-4和α-1,6）N-乙酰乳糖胺，这些在免疫识别和炎症过程中起作用；豌豆凝集素（PSA）靶向α-岩藻糖残基，参与病原体识别和免疫信号传导。凝集素浓度经过优化以确保全面标记（补充图1a–e），控制实验验证了凝集素对玻璃盖片的亲和力可以忽略不计（补充图1f）。
同时，通过将N-叠氮乙酰甘露胺（Ac4ManNAz）掺入细胞表面的唾液酸残基来应用代谢寡糖工程。代谢标记的唾液酸通过无铜点击化学与DNA编码的二苯并环辛炔（DBCO）结合。这种菌株促进的叠氮-炔环加成反应在生理条件下迅速进行，形成稳定的三唑连接，无需潜在的细胞毒性铜催化。此外，在没有叠氮基团的情况下，DBCO-DNA的非特异性结合最小。这种策略也与使用部分O-酰基化非天然叠氮糖的下一代代谢标记方法兼容。
由于糖萼的结构复杂性，通过超分辨率研究其结构获得的数据本质上很复杂。为了破译这种复杂性，仅仅视觉检查重建结果是不够的。因此，糖链图谱构建使用定量分析细胞表面糖链种类之间的纳米级空间关系。首先顺序捕获每个成像目标的原始定位数据，然后对这些定位数据进行漂移校正和对齐。接下来，分割感兴趣的区域，排除任何非细胞信号。然后进行聚类，将来自成像链和单个对接链重复相互作用的多个定位分组。将簇中心作为目标位置，我们将其称为“凝集素结合位点”。随后使用最近邻（NN）峰距离矩阵和GlyCo对目标位置进行定量分析（图1c,d），然后通过主成分分析（PCA）进行降维。补充图2显示了糖链图谱构建的关键步骤。NN分析用于揭示凝集素结合位点在空间分布中的全局模式，无需进一步假设。尽管NN分析对糖链的生化性质不了解，但GlyCo框架考虑了先前研究中已知的糖链的典型长度尺度。如果凝集素结合位点的距离在5纳米半径范围内，则将它们分组，假设在这个阈值或以下，它们属于同一糖链。这有助于重建整个糖链（亚）结构。无论如何，基于NN和GlyCo的分析都能追踪纳米级糖链组织如何反映不同的细胞状态，从而提供生物学上相关且可解释的空间数据（见“后处理”部分）。
糖链图谱构建在一系列复杂性逐渐增加的相关样本类型中得到了验证，确保在转移到更复杂的样本之前，在受控环境中进行了基准测试。研究的不同系统在图2a中以示意图形式表示。我们首先使用标准培养细胞系（图2b），然后是原代大鼠神经元（图2c）、人原代免疫细胞（图2d），最后是原代人组织（图2e）。每个样本都使用相同的协议进行标记和分析，仅根据所研究系统的具体要求进行了轻微调整（方法部分）。更多示例见补充图3。
简而言之，样本与DNA编码的凝集素一起孵育。对于MCF10A/AT细胞，还用Ac4ManNAz对唾液酸进行代谢标记，然后通过无铜点击化学连接对接链。然后对样本进行多重DNA-PAINT显微镜观察（补充图4显示了质量指标），数据分析和对获得的高维纳米级成像数据进行定量空间映射。通过这种方法，我们逐步从体外转移到体外，实现了跨细胞和组织的糖链图谱构建的稳健演示。对于图2b–e中显示的每种样本类型，分别以灰度形式展示了针对不同糖链种类的单独成像轮次的重建以及相应的标记剂。完整视野（FoVs）和放大视图与衍射极限图像一起显示，突出了分辨率的显著提高以及纳米级糖萼结构的成功可视化。特别是，这里展示了不同凝集素之间的定性差异，以及不同样本类型上相同凝集素之间的差异。这表明我们的方法即使在定性层面也具有目标和样本特定的读数潜力，我们将其扩展到定量层面。
作为第一个成像目标，我们选择了永生化乳腺上皮细胞（MCF10A）。此外，还包括了一个表达Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因的转化变体（MCF10AT）。这两种细胞系要么用肿瘤生长因子β（TGFβ）处理，要么不进行处理。因此，我们研究了MCF10A、MCF10A+TGFβ、MCF10AT和MCF10AT+TGFβ细胞系作为上皮-间质转化（EMT）的模型系统，这是癌症进展的关键步骤44,45。结合凝集素标记技术，我们对这些细胞上的末端唾液酸进行了代谢标记（图3a,b）。MCF10A细胞系的额外数据见补充图5。图3：糖胺聚糖图谱追踪早期致癌事件。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：a. （i）灰度下的单个通道。（ii）单个通道的合并数据（白色箭头指示此处分析的细胞；图2显示了颜色图）。（iii）明场（BF）视野。带有小箭头的插图表示b中显示的区域。b. 单个目标位置的聚类定位云的代表性示例。（i）原始定位。（ii）聚类定位。c. 一个代表性通道的NN直方图（PHA-L与所有通道的关系）。d. 所有比较中NN直方图的最大值。e. 来自GlyCo的凝集素类别分布。显示了十个最频繁的类别及其空间密度。f. e中显示的类别的空间排列。g. （i）GlyCo和（ii）所有样本的NN峰距离的PCA图，比较了模拟的四个EMT阶段。刻度尺，10 µm（a）；100 nm（b）。对于每种细胞类型，数据至少来自两次接种。
来源数据显示，在单个成像目标内的局部密度存在明显差异，同时不同目标之间存在全局差异（图3c–f）。此外，可以观察到不同唾液酸和岩藻糖连接的空间分布，分辨率达到纳米级别。最后，最引人注目的是，基于（i）GlyCo和（ii）NN峰分布的多维数据集的PCA（图3g）能够准确区分MCF10A细胞模型系统中的不同癌症进展阶段。为了表征基于PCA的分离是如何实现的，我们计算了主成分的载荷向量。这些载荷量化了每个原始变量（例如，特定的NN距离或GlyCo簇频率）与主成分之间的相关性。高绝对载荷值表明对该成分有很强的贡献（补充图6）。这项分析表明，没有单一的糖胺聚糖组织改变可以解释观察到的变化；相反，整体的重新分布是相关的。值得注意的是，TGFβ刺激的细胞簇比未刺激条件下的细胞簇更接近。这表明TGFβ刺激使MCF10A和MCF10AT细胞都趋向于一个密切相关的过度增殖表型，这反映在糖萼状态上。总体而言，特征性的纳米级糖萼特征准确地反映了细胞内部状态，而糖胺聚糖图谱能够检索这些信息。
接下来，我们对大鼠胚胎海马神经元进行了糖胺聚糖分析（图4）。原代神经元是从大鼠胚胎海马组织中提取的（方法）。研究中使用的神经元的额外数据见补充图7。图4：糖胺聚糖图谱揭示了特征性的神经元糖基化模式。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：a. （i）灰度下的单个通道。（ii）单个通道的合并数据（图2显示了颜色图）。（iii）明场视野。带有小箭头的插图表示b中显示的区域。b. 单个目标位置的聚类定位云的代表性示例。（i）原始定位。（ii）聚类定位。c. 一个代表性通道的NN直方图（PHA-L与所有通道的关系）。d. 所有比较中NN直方图的最大值。e. 来自GlyCo的凝集素类别分布。显示了十个最频繁的类别及其空间密度。f. e中显示的类别的空间排列。g. （i）GlyCo和（ii）所有样本的NN峰距离的PCA图，比较了神经元细胞体和树突之间的特征性糖基化模式。刻度尺，10 µm（a）；100 nm（b）。数据至少来自两次接种。
有趣的是，所研究的神经元中的PHA-L信号较低，这与报道的PHA-L在原代神经元培养中的复杂N-糖基化时间一致。因此，这一观察结果支持了我们的分析，因为复杂的N-糖基化预计会在成熟的原代神经元中变得显著，而这里研究的细胞处于发育的早期阶段46。与之前一样，糖胺聚糖图谱能够根据特征性的糖胺聚糖模式区分不同的分析条件。因此，糖胺聚糖图谱揭示了单个神经元内的差异性糖基化特征，这可能表明存在一个未识别的调控轴。例如，糖基化蛋白可能与凝集素结合，调节膜受体的驻留时间和内化动力学，如先前报道的47。
为了研究不同细胞状态下免疫细胞的糖萼功能结构，我们接下来对一系列不同的原代免疫细胞进行了糖胺聚糖分析（图5）。特别是，我们研究了原代自然杀伤（NK）细胞、原代CD4+ T细胞和原代中性粒细胞。研究中使用的原代免疫细胞的额外数据见补充图8。图5：糖胺聚糖图谱追踪免疫细胞激活。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：a. （i）灰度下的单个通道。（ii）单个通道的合并数据（白色箭头指示此处分析的细胞；图2显示了颜色图）。带有小箭头的插图表示b中显示的区域。（iii）明场视野。b. 单个目标位置的聚类定位云的代表性示例。（i）原始定位。（ii）聚类定位。c. 一个代表性通道的NN直方图（PHA-L与所有通道的关系）。d. 所有比较中NN直方图的最大值。e. 来自GlyCo的凝集素类别分布。显示了十个最频繁的类别及其空间密度。f. e中显示的类别的空间排列。g–i. （i）GlyCo和（ii）所有样本的NN峰距离的PCA图，比较了激活和非激活的NK细胞（g）、CD4+ T细胞（h）和中性粒细胞（i）之间的特征性糖基化模式。n = 4次独立分离，NK细胞每次染色两个细胞；n = 1次分离，两次独立接种和染色，CD4+ T细胞每次染色两个细胞；n = 2次分离，两次独立接种和染色，中性粒细胞每次染色一个细胞。刻度尺，10 µm（a）；100 nm（b）。
来源数据：NK细胞对先天免疫至关重要，它们能够在不进行新的糖胺聚糖或蛋白质生物合成的情况下快速产生细胞毒性反应48,49。我们的方法显示，在与A549靶细胞孵育5分钟后，NK细胞的糖萼发生了深刻而快速的纳米级重塑。特别是，存在信号明显增加和减少的区域，突出了相关尺度上的空间异质性提取。观察到的快速重组难以用生物合成的变化来解释，可能是由更快的机制驱动的50。其中之一可能是细胞毒性颗粒的外排51,52。这些颗粒与细胞膜的融合可能迅速改变了表面糖胺聚糖模式53。这种快速的膜融合和糖基化外泌体成分的插入可能对观察到的表面糖基化变化起到了核心作用54。此外，横向重新分布和聚集也可能起作用。快速的激活信号可以诱导特定糖缀合物的横向重新分布或聚集，这可能是由蛋白质-蛋白质相互作用、脂质微域动态或细胞骨架重排驱动的，从而改变纳米级模式55。细胞表面的酶修饰也可能起作用56。细胞表面的糖苷酶可以迅速修改现有的糖胺聚糖结构，快速改变糖胺聚糖表位和空间关系57。最后，糖缀合物的脱落或摄取可以导致细胞表面糖组的快速变化58。这种选择性的糖胺聚糖去除或获取可能有助于观察到的快速重塑59。糖胺聚糖图谱能够在免疫细胞激活的短时间内（例如，NK细胞为5分钟）精确识别NK细胞、CD4+ T细胞和中性粒细胞的激活状态。早期研究表明，细胞表面糖组的完全更新发生在相对较长的24–48小时内（参考文献60）。然而，这些研究关注的是糖萼整体的更新，而不是更微妙的结构变化。我们的分析表明，免疫细胞能够快速适应外部刺激，从而改变其细胞表面的糖基化模式。这表明糖萼在几分钟的时间尺度上非常动态，并且对细胞环境高度响应，显示出对外部明显且可区分的糖胺聚糖模式。
接下来，我们对原代患者组织切片进行了糖胺聚糖分析。我们研究了原代乳腺癌腺癌组织，同一切片中包含肿瘤区域和周围的非肿瘤区域，以便进行内部参考。肿瘤和非肿瘤区域的分类是通过组织病理学分级进行的。图6显示了对原代患者组织切片进行糖胺聚糖分析的结果。我们注意到，由于组织切割过程中会穿过细胞，因此在这种情况下，一些信号可能来源于尚未整合到糖萼中的糖胺聚糖，例如仍然位于高尔基体中。为了将来潜在应用的最小样本准备时间，我们决定不排除这种潜在来源，而是分析成像切片中的总信号。组织切片的额外数据见补充图9。图6：糖胺聚糖区分了健康组织和肿瘤组织。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：a. （i）灰度下的单个通道。（ii）单个通道的合并数据（白色箭头指示此处分析的细胞；图2显示了颜色图）。带有小箭头的插图表示b中显示的区域。（iii）明场视野。b. 单个目标位置的聚类定位云的代表性示例。（i）原始定位。（ii）聚类定位。c. 一个代表性通道的NN直方图（PHA-L与所有通道的关系）。d. 所有比较中NN直方图的最大值。e. 来自GlyCo的凝集素类别分布。显示了十个最频繁的类别及其空间密度。f. e中显示的类别的空间排列。g. （i）GlyCo和（ii）所有样本的NN峰距离的PCA图，比较了肿瘤和非肿瘤区域之间的特征性糖基化模式。刻度尺，10 µm（a）；100 nm（b）。数据来自两个组织切片。
事实上，基于PCA的分析通过分析其特征性的纳米级糖胺聚糖特征，能够识别肿瘤和非肿瘤区域。有趣的是，非肿瘤区域在PCA中形成了一个紧密的簇，而肿瘤区域则更加分散，这表明糖萼景观更加异质，与癌细胞中生物合成途径的调节失败一致61。
在这里，我们报告了糖胺聚糖图谱技术，它通过追踪纳米级糖萼结构全面地实现了细胞状态的表征。糖胺聚糖图谱整合了DNA-PAINT、生物正交化学和基于凝集素的糖胺聚糖靶向以及定量分析。除了建立方法并在一系列相关生物系统上展示它——从培养的细胞系到原代细胞再到患者组织——我们还识别了几种迄今为止未知的过程，这些过程在功能上将糖萼状态与细胞状态联系起来。特别是，我们的结果表明EMT强烈调节了糖萼结构。鉴于我们小组和其他人之前的研究表明癌症糖萼与癌症进展之间存在功能联系，糖胺聚糖图谱可能是一种非常有价值的方法，用于表征基础癌症生物学中的糖萼状态8,62。我们的结果进一步表明，在原代神经元中存在亚细胞水平的差异性糖基化状态，这引发了关于健康和疾病状态下神经元活动如何受到神经元糖萼纳米级结构调节的问题。值得注意的是，我们观察到NK细胞、CD4+ T细胞和中性粒细胞在免疫细胞激活后特定糖基化模式的快速重组。这一结果指向了一个迄今未被表征的动态糖萼适应轴，对糖免疫学和基于细胞的疗法具有深远的影响。最后，我们能够根据特征性的糖胺聚糖模式识别肿瘤组织。我们的观察结果与之前报道的癌细胞中异常的岩藻糖基化和岩藻糖转移酶的研究结果一致63,64。超越这些仅识别肿瘤细胞糖基化整体变化的研究，我们的方法允许直接在纳米级别上表征糖基化，直至不同的糖胺聚糖连接。了解这些糖萼结构的精确组织可能有助于更好地注释癌细胞的状态，并且在更临床的背景下，可能有助于开发针对性的诊断和治疗策略。糖链图谱的建立具有在临床诊断常规中应用的变革潜力，例如，可以通过根据肿瘤的功能性糖萼指纹对其进行分类。考虑到由Siglec–sialome轴介导的免疫细胞调节这一新兴领域，这一点尤为重要。尽管取得了这些进展，但这里介绍的糖链图谱方法仍存在局限性。首先，需要克服的一个关键障碍是特定糖链标记剂的可用性有限。与用于蛋白质或基因组序列的标记工具相比，针对糖链的标记技术目前发展得还不够成熟。这一领域的进步将立即扩大糖链图谱的应用范围。其次，我们的研究目前仅限于六种标记物种。最近的报告已经展示了更多的可标记目标，这些策略的实施肯定将对未来糖链图谱的发展非常有价值。然而，我们注意到实验复杂性和时间需求随着成像物种数量的增加而增加。因此，任何实施都应在可行性和范围之间取得平衡。基于这里呈现的结果，我们有信心当前的成像目标数量能够提取出有意义的纳米级糖萼特征。如果考虑的物种较少，分离能力会降低；因此，建议选择的物种数量是合理的（见补充图10）。第三，虽然糖链图谱与临床样本兼容，但其当前的实施需要实验者具备高水平的专业知识和大量的手动操作时间，这可能阻碍了其广泛的临床应用。在这方面，数据采集和分析自动化方面的创新将非常重要。最后，目前对NN距离的分析仅考虑了提取分布的峰值位置，基本上是将直方图投影到一个用于进一步分析的单一值上。更先进的方法可能会从数据集中提取出更精细的信息。为了测试这一点，我们对完整的NN距离分布进行了PCA分析，结果显示条件之间的分离效果良好（见补充图11）。然而，值得注意的是，尽管数据集的复杂性降低了，但仍然可以精确地提取特征，这表明了我们方法的高鲁棒性。
从实验角度来看，Glyco-STORM23将是成像细胞器糖基化的合适方法。对于追踪糖链动态，Lectin-PAINT24似乎是一个推荐的选择，而这里介绍的糖链图谱方法是分析糖链结构及其与细胞状态关系的纳米级分析的首选方法。此外，如果需要单糖分辨率，我们最近发表的方法通过顺序成像来增强分辨率，应该被考虑使用。
总之，糖链图谱提供了一种通过分析糖萼的纳米级结构并识别特征性糖链模式来表征不同生物系统中细胞状态的全面方法。能够在纳米尺度上量化和可视化糖萼特征的能力为深入理解细胞行为和发展针对性疗法提供了巨大潜力。因此，糖链图谱是基础糖生物学中的一个强大工具，具有推动生物医学研究和临床应用创新的潜力。
**方法**
**伦理声明**
该研究符合所有伦理规定。从人血中分离免疫细胞和分析人原代组织得到了埃尔朗根大学诊所伦理委员会的批准（参考编号22-321-Bp和24-349-Bp）。
**细胞培养**
MCF10A/AT细胞在T-25培养瓶（Greiner Bio-one，目录编号690175）中培养，培养基为Dulbecco改良Eagle’s培养基/F12（Gibco，参考编号21041-025），补充了5%马血清（Gibco，参考编号16050-112）、20 ng ml^-1表皮生长因子（Gibco，参考编号PHG0311）、0.5 μg ml^-1氢化可的松（Sigma-Aldrich，参考编号H0396）、100 ng ml^-1霍乱毒素（Sigma-Aldrich，目录编号C8052-5MG）、10 μ ml^-1胰岛素（Sigma-Aldrich，目录编号I1882-100MG）和1%青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，目录编号P0781-100ML）。细胞在含5% CO2的湿润气氛中维持在37°C。当细胞密度达到70%-80%时，用5 ml无Ca2+/Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS，Gibco，参考编号14190-094）洗涤细胞，并通过短暂孵育0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Gibco，参考编号2500-054）进行酶解8-10分钟。胰蛋白酶中和后，细胞以3000g离心5分钟，所得沉淀物重新悬浮在5 ml完全培养基中。对于实验测定，细胞以1:10的稀释度接种到八孔培养皿（ibidi，参考编号80807-90）中，并在样品制备前孵育24小时。对于经过TGFβ处理的MCF10A/AT变体，细胞在含有5 ng ml^-1 TGFβ（Bio-Rad，参考编号PHP143B）的培养基中培养四代。之后，细胞继续在不含TGFβ的完全培养基中培养。
A549细胞在T-25培养瓶中培养，培养基为RPMI-1640（Gibco，参考编号31870-025），补充了10%胎牛血清（Gibco，参考编号A31605-02）、1%青霉素-链霉素和1% GlutaMAX（Gibco，参考编号35050-38）。细胞在含5% CO2的湿润气氛中维持在37°C。当细胞密度达到70%-80%时，用5 ml无Ca2+/Mg2+的DPBS洗涤细胞，并通过短暂孵育0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液进行酶解8-10分钟。胰蛋白酶中和后，细胞以3000g离心5分钟，所得沉淀物重新悬浮在5 ml完全培养基中。对于共培养实验，细胞以1:10的稀释度接种到八孔培养皿中，并在实验操作前孵育24小时。
**原代NK细胞的分离、扩增及样品制备**
NK细胞使用NK细胞分离试剂盒（Stem Cell Technologies，目录编号19665）根据制造商的说明从外周血中分离，包括密度梯度离心和磁珠分离。然后使用NK细胞扩增试剂盒（Stem Cell Technologies，目录编号100-0711）扩增分离出的NK细胞，该试剂盒包括基础培养基（Stem Cell Technologies，目录编号100-0712）、补充剂（Stem Cell Technologies，目录编号100-0715）和包被材料（Stem Cell Technologies，目录编号100-0714）。简要来说，一个24孔板（Stem Cell Technologies，目录编号38044）用包被材料包被并在室温下孵育2小时，然后用无Ca2+/Mg2+的DPBS冲洗。分离出的NK细胞以1 × 10^6细胞 ml^-1的密度接种到包被板上，在37°C和5% CO2下孵育。在第3或第4天，加入额外的扩增培养基，并继续孵育。在第7天和第10/11天，通过无Ca2+/Mg2+的DPBS收获细胞，并重新接种到新的包被八孔板上（2 × 10^5细胞 μg ml^-1），在新鲜扩增培养基中孵育72小时以准备固定样品。
**NK细胞与A549细胞的共培养**
A549细胞以1:10的浓度接种到NK细胞表面包被的八孔板上，并在含5% CO2的湿润气氛中孵育24小时以促进适当附着和生长。另外，之前分离和扩增的NK细胞被重新悬浮用于传代和共培养实验。对于共培养实验，将重新悬浮的细胞以2 × 10^5细胞 ml^-1的浓度加入到A549细胞中。共培养在37°C和5% CO2下孵育5分钟，期间NK细胞附着在A549癌细胞上。使用光学显微镜密切监测NK细胞和A549细胞之间的相互作用。一旦观察到NK细胞和A549细胞之间的物理相互作用，立即固定样品。
**组织切片制备**
样品来自埃尔朗根大学诊所的中心生物库。冷冻切片使用4%甲醛固定20分钟，然后转移到#1.5玻璃载玻片上。在成像之前，将一个腔室（ibidi sticky slides，参考编号80427）放在玻璃载玻片上，并填充PBS以方便染色、成像仪条添加和洗涤步骤。
**Ac4ManNAz和无铜点击化学的代谢标记**
对于唾液酸的代谢标记，如上所述将MCF10A/T细胞接种到载玻片上。3小时后，向细胞培养基中添加50 µM Ac4ManNAz并孵育72小时。孵育后，用无Ca2+/Mg2+的DPBS洗涤细胞两次，然后用含有50 µM DBCO（与对接链R6结合）的标准培养基在孵育器中孵育2小时以促进点击反应。之后，固定细胞并用凝集素染色。
**原代神经元培养**
E18 Sprague Dawley大鼠的海马体（Transnetyx，SKU编号SDEHP）在冰冷的Hanks平衡盐溶液（Thermo Fisher，目录编号14175095）中洗涤三次，其中含有1%青霉素-链霉素（Thermo Fisher，目录编号15140122）。然后在37°C下用0.05%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录编号15400054）孵育10分钟。去除胰蛋白酶后，用预热的Hanks平衡盐溶液（含有1%青霉素-链霉素）洗涤组织十次。将Hanks平衡盐溶液替换为1 ml温热的Neurobasal培养基（Thermo Fisher，目录编号12348017），其中补充了1%青霉素-链霉素、1% GlutaMAX（Thermo Fisher，目录编号35050061）和2% B27（Thermo Fisher，目录编号1750404）。然后用200-µl移液器上下机械分离细胞约30次。此外，将100,000–150,000个细胞接种到涂有10 µg ml^-1聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录编号p6407-5mg）和1 µg ml^-1层粘连蛋白（Merck，目录编号L2020-1MG）的玻璃底Petri皿中，培养基为含有1%青霉素-链霉素、1% GlutaMAX和2% B27的Neurobasal培养基。第二天更换培养基，之后每3天更换一半培养基。
**原代人类CD4+ T细胞的分离、激活和制备**
从健康捐赠者的血液样本中分离CD4+ T细胞。首先，通过Ficoll梯度分离（Ficoll-Paque PLUS，VWR）收集外周血单核细胞。然后使用市售的CD4+ T细胞分离试剂盒（Miltenyi）根据制造商的说明分离CD4+ T细胞。这里将0.5 × 10^6 CD4+细胞重新悬浮在Iscove改良的Dulbecco培养基（Gibco）中，补充了10%胎牛血清（PanBiotech）和1%青霉素-链霉素（Gibco）。为了激活细胞，还提供了抗人类CD3（α-CD3，1 µg ml^-1，Ultra-LEAF纯化抗人类CD3抗体，BioLegend）和抗人类CD28（α-CD28，2 µg ml^-1，Ultra-LEAF纯化抗人类CD28抗体，BioLegend）以及重组人类IL-2（20 ng ml^-1，ImmunoTools）。细胞在37°C和5% CO2下培养3天。作为对照，使用同一捐赠者的未刺激和新鲜分离的CD4+ T细胞。然后使用4%甲醛在室温下固定样品10分钟，并用PBS洗涤三次。
**原代人类中性粒细胞的分离、激活和制备**
使用市售的试剂盒（MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit，Miltenyi）根据制造商的说明分离人类中性粒细胞。然后，在含有10%胎牛血清（PanBiotech）和1%青霉素-链霉素（Gibco）的RPMI-1640培养基（Gibco）中培养10^6中性粒细胞。对于刺激条件，还添加了重组人类肿瘤坏死因子-α（100 ng ml^-1，ImmunoTools），并在37°C和5% CO2下培养2小时。未刺激的中性粒细胞在相同的条件下培养，但不添加肿瘤坏死因子-α。使用4%甲醛在室温下固定样品10分钟，并用PBS洗涤三次。
**样品固定**
样品用DPBS和Ca2+/Mg2+（Gibco，参考编号14040-091）洗涤三次。然后，将4%甲醛从16%储备溶液（Thermo Scientific，参考编号28908）稀释至4%工作溶液，并加入到孔中，细胞在室温下孵育15分钟。之后，用无Ca2+/Mg2+的DPBS洗涤细胞三次。固定后，用0.1% Triton X（Alfa Aesar，目录编号A16046）在室温下渗透细胞10分钟，接着用四次DPBS和无Ca2+/Mg2+的洗涤步骤。
**凝集素标记**
在1× Tris缓冲液（Fisher Bioreagents，参考编号M-15836）中制备的凝集素混合物（每种凝集素2.5 µg ml^-1）在室温下应用于细胞30分钟，以特异性结合细胞表面的糖链目标。孵育后，用无Ca2+/Mg2+的DPBS洗涤细胞三次。对于MCF10A细胞面板，首先用0.1% Triton X-100在室温下预渗透10分钟，然后进行四次无Ca2+/Mg2+的DPBS洗涤步骤，并按上述方法孵育凝集素。在成像之前，再次用0.1% Triton X-100在室温下渗透细胞10分钟，然后进行四次无Ca2+/Mg2+的洗涤步骤。对于原代神经元，使用0.1%的Triton X-100进行渗透处理10分钟，温度为室温，随后用不含Ca2+/Mg2+的DPBS清洗四次，然后进行成像。对于原代免疫细胞和组织切片，样品用0.2%的Triton X-100在室温下渗透处理10分钟，再用不含Ca2+/Mg2+的DPBS清洗四次。为了测试固定效果，我们颠倒了处理顺序，先进行活细胞染色（使用WGA），然后再进行固定。观察到的差异不明显（见补充图12）。
**光学设置**
DNA-PAINT成像是在倒置显微镜（Nikon Instruments, Eclipse Ti2）上进行的，配备了Perfect Focus System。使用基于物镜的总内反射荧光（TIRF）模式，采用高数值孔径物镜（Nikon Instruments, Apo SR TIRF ×100，数值孔径为1.49，油浸式）和Nikon TIRF模块。激发光使用560纳米激光器（MPB Communications，1瓦），通过TIRF模块导入显微镜。激光功率通过滤光轮（Thorlabs, FW212CNEB）在自由空间中调节。激光束通过一个清洁滤光片（Chroma Technology, ZET561/10），然后通过分光镜（Chroma Technology, ZT561RDC）导入显微镜物镜。荧光信号通过发射滤光片（Chroma Technology, ET600/50m和ET575LP）进行光谱过滤，并在科学级互补金属氧化物半导体相机（Hamamatsu Orca Fusion）上成像，未经进一步放大，经过2×2合并后有效像素大小为130纳米。所有测量都使用TIRF照明，激光功率约为物镜处的33毫瓦。相机的中心区域为1,152×1,152像素（合并后为576×576像素）作为感兴趣区域。原始显微镜数据使用μManager（v. 2.0.3）采集。
**DNA序列**
用于DNA-PAINT的对接和成像链序列已经过优化，以确保正交结合特异性。所使用的序列如下：
R1（WGA）使用5×R1序列TCCTCCTCCTCCTCCTCCT
R2（SNA）使用5×R2序列ACCCACCACCACCACC
R3（PHA-L）使用7×R3序列CTCTCTCTCTCTCTCTC
R4（AAL）使用7×R4序列ACACACACACACAC
R5（PSA）使用5×R5序列CTTTCTTCTTCTTCT
R6（DBCO）使用5×R6序列AACAACAACAACAACAA
所有DNA寡核苷酸均通过高效液相色谱法纯化，并由Metabion提供。
**DNA-PAINT成像的成像链制备**
成像缓冲液通过将50毫升不含Ca2+/Mg2+的DPBS与0.0146克EDTA（PanReac，目录号60-00-4）、1.461克氯化钠（Alfa Aesar，目录号A12313）和10微升Tween-20（MP Biomedicals，目录号103368）混合在50毫升Falcon管中制备。所有成分充分混合直至完全溶解。制备好的缓冲液在4℃下保存，直到下次使用。DNA-PAINT的成像链通过将1微摩尔的储备溶液稀释到缓冲液中制备，最佳成像浓度范围为0.075至0.5纳摩尔，根据样品类型和目标进行调整，以获得稀疏的单分子信号。
**多重DNA-PAINT**
DNA-PAINT成像通过六轮连续成像进行，每轮只使用一种成像剂。对于每个目标，捕获20,000帧单分子闪烁图像，帧时间为100毫秒。物镜处的激光功率约为33毫瓦。在成像轮次之间，用不含Ca2+/Mg2+的DPBS彻底清洗至少四次，确保没有前一轮成像剂的残留信号。
**样本数量**
对于MCF10A细胞系，展示了两次独立接种的数据。每次接种独立染色。每个染色的数据来自至少两个细胞。对于神经元，展示了两次独立接种的数据。每个染色的数据来自至少一个细胞。对于NK细胞，展示了四次独立分离的数据。每次分离的数据来自至少两个细胞。对于T细胞，展示了一次分离的数据。分离的细胞在两个独立样本中染色。每个染色的数据来自至少两个细胞。对于中性粒细胞，展示了两次分离的数据。每次分离的数据在两个独立样本中染色。每个染色的数据来自至少一个细胞。对于组织切片，展示了两个独立切片的数据。每个切片在两个独立样本中染色。展示了至少两个视野的数据。
**统计和重复性**
没有使用统计方法预先确定样本数量。分析过程中没有排除任何数据。实验过程中和结果评估时，研究者对样本分配情况不知情。
**后处理**
原始荧光数据使用Picasso软件包（v. 0.7.4）重建。为了识别每帧中的独立闪烁事件，使用了5,000的强度阈值。通过冗余互相关进行漂移校正，随后使用金纳米颗粒进行精确的基于基准点的漂移校正。六个通道使用金纳米颗粒作为基准标记进行对齐。使用Picasso的多边形选择功能分割感兴趣区域（分析中不包括细胞外的信号）。分割后的所有下游分析，直到计算簇中心，都是使用Python中的自定义Picasso版本完成的。使用基于神经网络的算法（NN-based analysis）计算每个图像通道的实验定位精度。对于聚类，使用了实验NN-based分析精度两倍的半径。每个簇内的最小定位数量为两个。分析每个簇内闪烁事件的时间特征，以排除非特异性粘附事件。如果一个时间窗口（200帧，即堆栈总长度的1%）包含该簇中90%以上的事件，则该簇被拒绝。因此，单个和/或异常延长的事件被视为错误定位。计算簇中心，并将其作为糖胺聚糖目标的位置。
**进一步分析**
采用了两种方法进行进一步分析。首先，我们计算了所有糖胺聚糖定位之间的NN距离，包括同一通道内和不同通道间的距离。绘制了到第一个NN的距离直方图，并将分布的峰值收集在一个5×5矩阵中（对于含有DBCO的数据集为6×6）。其次，我们对在同一通道内和跨通道中空间邻近频繁出现的凝集素结合位点进行了分类，使用5纳米的截止半径。将每两个或更多凝集素结合位点的组合分配到不同的类别中。绘制了每个平方微米内的类别分布，并映射了这些类别的细胞位置。为了处理这些多维数据，我们使用Python中的PCA进行了标准线性降维。
**报告摘要**
有关研究设计的更多信息，请参阅与本文关联的Nature Portfolio Reporting Summary。
