摘要
引言
在妊娠期间，含有Fc结构域的分子向胚胎-胎儿的转移和生物分布存在物种差异。本文回顾了胎盘的形成过程，并研究了不同物种在整个妊娠期间绒毛尿囊胎盘（CAP）和/或倒置卵黄囊胎盘（InvYSP）中胎盘新生儿Fc受体（FcRn）的定量情况，以进一步了解这些分子的发展毒性测试。方法
使用定量质谱技术对小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人灵长类动物（NHP）妊娠期间CAP和/或InvYSP中的FcRn蛋白进行了定量分析。在人类胎盘组织中，通过免疫组化方法确定了每个妊娠阶段的FcRn分布情况。
结果
在小鼠、大鼠、豚鼠和兔子中，FcRn蛋白在整个妊娠期间都被检测到，并且其浓度逐渐增加；而在所有妊娠阶段，InvYSP中的FcRn浓度明显高于CAP。相比之下，NHP的FcRn蛋白浓度在妊娠期间保持稳定。在人类中，妊娠第一阶段，FcRn存在于蜕膜、母体内皮以及母体和胎儿的巨噬细胞中。妊娠第二阶段，胎儿的FcRn在合胞滋养层和胎儿绒毛血管中增加。妊娠后期，母体内皮中的FcRn表达减少。
结论
所有动物物种的胎盘组织中都检测到了FcRn蛋白，并且其浓度在整个妊娠期间都有所增加。无论FcRn的位置如何，这些数据都表明含有Fc结构域的分子可以在整个妊娠期间进入胚胎-胎儿。转移的程度可能取决于FcRn的浓度和胎盘的大小。这些关于胎盘FcRn发生发展的信息将有助于改进研究设计，并将非临床发展毒性数据转化为对含有Fc结构域的分子的人类安全性评估。
1 引言
包括Fc结构域在内的大型生物分子，如单克隆抗体（mAbs）和类似免疫球蛋白G（IgG）的分子，正在以快速的速度被开发用于治疗影响两性并贯穿所有生命阶段的疾病，包括生殖活动期。许多疫苗的有效性依赖于免疫反应，这可能涉及母体IgG的胎盘转移（Etti等人，2022年）。由于后代可能从这些疗法中受益，或者有可能接触到为具有生殖潜力的女性设计的含有Fc结构域的生物制药产品，因此了解这些分子通过胎盘转移的可能性和程度非常重要。因此，必须研究转运机制，以确定母体IgG和含有Fc结构域的生物制药产品（以下简称含有Fc的结构域的分子）在妊娠期间是否、在多大程度上以及何时穿过胎盘。本研究首先回顾了胎盘的发育、结构以及含有Fc的结构域的分子的转运方式。关于用于安全性评估的物种之间胎盘的比较解剖学和发育的更多细节已在其他地方描述（DeSesso 2012；DeSesso等人2012；Kaufmann和Burton 1994；Ramsey 1982）。因此，本研究将重点关注含有Fc的结构域的分子从母体系统转运到后代的时机、位置和机制的相似性和差异。然后，将分享关于用于发展毒性测试的测试物种以及人类的倒置卵黄囊胎盘（InvYSP）和绒毛尿囊胎盘（CAP）中FcRn蛋白浓度的新信息。所有这些信息将有助于更好地理解如何利用这些不同的测试物种来进行发展毒性测试，以评估对人类的风险。
1.1 早期发育、胎儿膜和胎盘的形成
排卵将减数分裂的卵子与母体卵巢中容易获得的营养物质分离。卵子被一层支持细胞包围，释放到一个技术上或物理上位于女性体外的空间中。如果发生受精，减数分裂完成，一个新的二倍体生物（受精卵）开始一系列快速的有丝分裂活动。受精卵的存活依赖于有效的氧气和营养物质供应以及代谢废物的清除方式。对于胎生动物（产活体的动物），这一生存挑战通过建立一个临时器官——胎盘来应对，胎盘在妊娠期间作为母亲和后代之间交换营养物质、气体、代谢废物和外来物质的接口。在本文考虑的哺乳动物物种中，受精发生在子宫管的远端，受精卵经历有丝分裂分裂，形成一群细胞，这些细胞穿过子宫管并进入子宫腔。随着继续发育，这群细胞重新排列成一个球体，内部是一个小的细胞团（真正的胚胎），外部是一层细胞（滋养层），滋养层附着并侵入子宫壁。与滋养层相关的组织分化为胎儿膜，这些膜与子宫内膜紧密接触，形成胎盘。胎盘和胎儿膜是妊娠早期形成的临时器官，仅存在于子宫内。它们作为营养和呼吸的器官，提供清除代谢废物的机制，保护胚胎/胎儿，并帮助建立胚胎血管系统。四种哺乳动物的胎儿膜包括绒毛膜、卵黄囊、羊膜和尿囊。绒毛膜由滋养层和下面的间充质组成。卵黄囊是中肠的腹侧内胚层突起，被间充质包围。羊膜包围着胚胎，来源于上胚层，并在脐部与皮肤的外胚层连续。尿囊是后肠内胚层的突出部分，与泄殖腔/膀胱的发育有关，对胎盘的胚胎血管系统的建立很重要。胎盘的母体部分通常是子宫壁（子宫内膜），胎儿部分由一个或多个胎儿膜组成。胎盘的类型可以根据参与胎儿-母体组织接触的胎儿膜以及参与胎盘血管化的膜来分类。通常用于发展毒性评估的哺乳动物具有典型的绒毛尿囊胎盘（CAP），这与人类的胎盘类型相同。此外，所有考虑的物种都具有血绒毛膜胎盘，这意味着母体血液直接接触绒毛膜上皮。本文考虑的物种的绒毛膜上皮具有与非人灵长类动物（NHP）和人类相同的特殊结构、细胞和过程（双向跨细胞转运和内体保护）。一个区别是，NHP和人类的胎盘具有绒毛以增加生理交换的表面积，而啮齿动物和兔子具有迷路状胎盘。迷路状排列比绒毛胎盘更有效地进行分子交换。
1.2 倒置卵黄囊胎盘
哺乳动物之间的妊娠里程碑序列是一致的（图1），尽管事件的时间点差异很大（表1）。通过胎盘高效地向胚胎转移物质需要建立一个功能性的胚胎心血管系统，这需要时间。在妊娠期较短的物种（如啮齿动物）中，大部分器官形成在胚胎心血管系统和CAP完全功能化之前完成，大约在20体节阶段开始（表1；图1中的黄色箭头）。然而，小鼠、大鼠和兔子的妊娠期较短（19-32天），因此这些物种的胚胎必须快速发育。快速发育要求从母体系统输送营养物质。为了满足其迅速生长的胚胎的需求，这些物种发展出一个早期胎盘，该胎盘利用了它们较大的卵黄囊（Jollie 1990）。这种早期胎盘在妊娠期较长的物种（包括NHP和人类）中不存在，被称为“倒置”卵黄囊胎盘（InvYSP），因为部分卵黄囊壁膜在接触子宫壁的平面上变薄并变得不连续，使得卵黄囊内胚层的上皮几乎直接接触子宫腔和上皮（图2）。InvYSP通过“组织营养”过程将营养物质输送到胚胎（图3）。这包括卵黄囊内胚层对子宫分泌物中的母体来源的大分子进行内吞作用，随后在溶酶体空泡中酶解这些大分子，然后扩散到胚胎中。一旦CAP开始发挥作用，啮齿动物InvYSP的营养重要性大大降低。尽管如此，InvYSP在整个妊娠期间仍然具有功能性（Beck和Lloyd 1977；Ornoy和Miller 2023），并在下面描述的被动免疫建立中起重要作用。
图1：胚胎发育的图解表示。从受精（左）到发育成熟（右）的进展。标记为“CAP”的黄色箭头表示绒毛尿囊胎盘建立的时间。圈出的字母表示表1中列出的物种的妊娠里程碑。这些分裂和分化途径与胚胎-胎儿暴露于含有Fc的结构域的分子后的潜在影响相关。橙色箭头代表可能的分化途径，一系列箭头表示分裂过程中发生的快速细胞分裂。分化的不同方向箭头表示组织在分化过程中做出的发育决策。随着每个后续的发育决策，细胞的发育潜力降低，而其分化状态增加（DeSesso和Williams 2018，《综合毒理学》第三版，CA McQueen编辑，Elsevier许可）。
表1：不同物种之间妊娠里程碑的时间比较。图1中标记的里程碑
a
种类
植入
原始条纹
早期分化
InvYSPb
CAPc
器官形成结束
通常的分娩时间
小鼠
4.5–5
6.5
8
7.2
9.2
15
19–20
大鼠
5.5–6
8.5
10
9.5
11.5
17
21–22
兔子
7–7.5
7.25
8.5
9
12.5
19.5
30–32
豚鼠
6–6.5
12–13
14.5
13–14
12
26
~65
猴子
9
15–17
21
NAe
~23
~45–46
166
人类
6–7
13.5
21
NAe
28
~53–63
266
a
日期以妊娠天为单位（Beck和Lloyd 1977；DeSesso 2012；Harmon和Dobrovolny 1933；Harmon和Prickett 1932；Vasconcelos等人2013）。
b
倒置卵黄囊胎盘（InvYSP）在妊娠第一天开始具有功能。
c
绒毛尿囊胎盘（CAP）在妊娠第一天开始具有功能。
d
豚鼠在胎盘出现顺序上是一个例外（Vasconcelos等人2013）。
e
不适用——这些物种没有倒置卵黄囊胎盘。
图2：啮齿动物倒置卵黄囊胎盘的发育。在啮齿动物中，一个由卵黄囊上皮组成的早期临时胎盘在第二妊娠周中期形成。这发生在卵黄囊迅速扩张（A）以填充绒毛腔（体腔）时。这种扩展导致卵黄囊上皮与绒毛膜接触（B）；随后，卵黄囊的腔体“塌陷”，使得外层（壁层）卵黄囊膜继续与绒毛膜保持接触，而内层卵黄囊膜则靠近壁层卵黄囊膜（C）。随着发育的继续，绒毛膜和壁层卵黄囊膜都会退化，最终只剩下内层卵黄囊膜与子宫腺体的分泌物接触（C插图），这些分泌物可以被内吞小泡吸收。这些内吞小泡与溶酶体融合，其内容物被分解酶消化。消化后的物质随后被转运到胚胎中（详见图3）。24-72小时后，尿囊与绒毛膜连接，形成绒毛尿囊胎盘（D）（DeSesso等人，2012年）。图3可在图查看器中打开。
在倒置卵黄囊胎盘中，营养物质通过这种方式被吸收。该图展示了通过倒置卵黄囊胎盘从子宫分泌物中吸收物质并将其转运到啮齿动物胚胎的过程。母体组织位于图的下部；胚胎组织位于上部。母体组织和胚胎组织之间的不连续区域是壁层卵黄囊内胚层与绒毛膜退化的地方，这使得内层卵黄囊内胚层能够接触到子宫腺体的分泌物。正是这种结构（内层卵黄囊紧贴子宫腔）导致了“倒置”这一术语的诞生。（1）子宫分泌物中的物质被内层卵黄囊的内胚层细胞吸收进入膜结合的小泡中。（2）这些膜结合的小泡移动到核上方的位置，然后被溶酶体接近。（3）溶酶体与膜结合的小泡融合形成次级溶酶体，次级溶酶体的内容物被酶分解。（4）消化后的物质从次级溶酶体扩散到内胚层细胞内部（在紧密连接下方），然后释放到细胞外空间，并进一步扩散到卵黄血管系统的胚胎毛细血管中。InvYS：倒置卵黄囊（DeSesso等人，2012年）经许可使用。
需要注意的是，虽然所有哺乳动物都会发育出卵黄囊，但其大小因物种而异。正如Carney等人（2004年）所指出的，啮齿动物的卵黄囊在妊娠早期会显著增大，以至于与绒毛膜接触；而在大猿和人类中，卵黄囊则保持为一个较小的结构（图4）。
人类卵黄囊的发育过程如图所示，分别展示了妊娠24天、28天和37天的胚胎、绒毛膜和卵黄囊的相对大小和位置。可以看出，在早期发育阶段卵黄囊是一个明显的结构，但其大小相对于不断增长的胚胎来说仍然较小，且既不与绒毛膜接触，也不会发生倒置以包裹胚胎（Carney等人，2004年）经许可使用。
1.3 转运机制
存在多种分子跨胎盘转运的机制，包括被动扩散和载体介导的转运（Carney等人，2004年；Miller等人，1976年；van der Aa等人，1998年）。小分子（如尿素、氧气、二氧化碳以及许多分子量小于600 Da的外源物质）通过扩散穿过胎盘。大多数小分子药物和化学物质也是通过被动扩散穿过胎盘的。因此可以合理假设，这些物质在胚胎/胎儿血液中的浓度与其在母体血液中的浓度成正比。相比之下，生物制药产品（例如寡核苷酸和肽）的分子量远大于小分子药物，其体积较大，阻碍了它们在胎盘中的有效被动转运。免疫球蛋白IgA、IgM、IgE、IgD以及其他缺乏Fc结构的抗体片段无法（或只能部分）穿过胎盘（Gitlin等人，1964年；Miller等人，2003年；Wakefield等人，2011年）。而IgG抗体则通过特殊的转运机制进入发育中的后代体内。IgG抗体是健康母体动物体内自然存在的蛋白质，在婴儿生命最初的脆弱时期提供保护。含有Fc结构的分子（如IgG抗体）通过受体介导的机制以特定于分子、物种和妊娠阶段的方式穿过胎盘。这种转运机制涉及IgG的Fc结构域被FcRn受体识别。类似抗体的生物制药产品（如单克隆抗体）也具有Fc结构域，可以利用这种转运机制。因此，含有Fc结构的生物制药产品和疫苗诱导的母体IgG的发育毒性评估可能与小分子不同，因为它们的生物分布特性可能有所不同。含有Fc结构的生物制药产品是目前监管机构批准速度最快的新型药物类别（Beck等人，2010年）。不出所料，目前有许多这类生物制药产品正处于不同的研发阶段。类似抗体的生物制药产品（如单克隆抗体、双特异性和三特异性抗体、抗体-药物偶联物、Fc融合蛋白）相比小分子药物具有多种优势，包括高靶点特异性、低脱靶效应和相对较长的半衰期。然而，如上所述，这些生物制药产品的安全性评估可能需要针对具体情况进行（ICH_S6(R1) 2011；Subramanyam等人，2008年）。生物制药产品应在其对药物具有药理活性的物种中进行测试（即测试物种中必须存在相应的药理靶点），并且这种药理活性也需要在毒理学上具有相关性。这通常意味着需要确定合适的非临床测试物种（见下文）。载体介导的转运机制可能（主动转运）或可能不需要（促进扩散）能量来穿过胎盘。虽然小分子可以利用前三种机制，并且几乎在妊娠的所有阶段都能进行跨胎盘转运，但含有Fc结构的分子的跨胎盘转运会受到暴露时的妊娠年龄以及吸收表面是否表达相应受体分子等因素的影响。
1.4 免疫球蛋白的结构及其在胎盘转运中的知识现状
免疫球蛋白对于介导被动免疫非常重要，但胎儿自身几乎不合成这些分子，必须从母体获取。其中，IgG是主要的胎儿免疫球蛋白，也是唯一大量穿过胎盘的免疫球蛋白（Malek 2003年；Malek等人，1994年）。IgG是大型分子，分子量约为150 kDa，呈“Y”形，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。“Y”形的茎部（Fc区域）是一个恒定结构，能够与Fc受体（FcR）结合。抗体的结合部分（“Y”的分支）具有可变结构。IgG分子的大尺寸阻碍了它们通过扩散穿过完整的上皮细胞；然而，由于IgG和其他含有Fc结构的分子的Fc区域是恒定的，它们可以通过与FcR的结合进行受体介导的内吞作用，其中在妊娠期间最重要的是新生儿Fc受体（FcRn）（DeSesso等人，2012年；Pentsuk和van der Laan 2009年；Roopenian和Sun 2010年）。
1.5 新生儿Fc受体（FcRn）
FcRn以较高的亲和力结合所有亚类的IgG单体和其他含有Fc结构的分子（Baker等人，2009年；Firan等人，2001年；Kristoffersen和Matre 1996年；Roopenian和Akilesh 2007年；Simister和Story 1997年）。在极化细胞的稳态条件下，大部分FcRn会积累在亚顶囊泡中（Baker等人，2009年；Simister等人，1996年；Story等人，1994年），并参与双向跨细胞转运。当一个含有Fc结构的分子完成跨细胞转运后，FcRn可以被重新内化以供再次使用，表明FcRn起到了穿梭作用（Antohe等人，2001年；Praetor等人，1999年）。妊娠期间，FcRn定位于合胞滋养层细胞的细胞内囊泡中（图5）（Antohe等人，2001年；Leach等人，1996年；Saji等人，1999年；Simister等人，1996年），但不在顶膜表面（Kristoffersen和Matre 1996年）。FcRn与其配体的结合依赖于pH值，即在pH ≤ 6.5时结合，而在pH ≥ 7.0–7.5时不会结合（Baker等人，2009年；Ghetie和Ward 1997年；Simister等人，1996年；Story等人，1994年）。这意味着FcRn只有在配体被内化到酸化的FcRn含有囊泡后才会与其结合。图5可在图查看器中打开。
IgG分子进入灵长类动物胚胎的转运途径：在人类和非人类灵长类动物中，母体血液中的IgG通过绒毛尿囊胎盘中的FcRn受体进入后代体内（啮齿动物的合胞滋养层中不存在FcRn受体）。在人类和灵长类动物中，母体血液中的IgG漂浮在接触胎盘胚胎部分的合胞滋养层细胞的血浆中。IgG分子被合胞滋养层的内吞小泡吸收（1和2）。当小泡与溶酶体融合时，溶酶体释放的酶使小泡内的液体酸化（3）。酸性环境促进了IgG与小泡内共存的FcRn受体的结合。结合了FcRn的IgG分子受到溶酶体的保护，不会被分解（4）。小泡穿过细胞并与基底细胞膜融合，将其内容物释放到胚胎组织的中性pH环境中。在中性pH条件下，IgG从FcRn受体释放并扩散到胎盘胚胎部分的毛细血管中（5）。CAP：绒毛尿囊胎盘（DeSesso等人，2012年）经许可使用。相比之下，啮齿动物主要在InvYSP内胚层细胞中表达FcRn（Kim等人，2009年）。无论FcRn受体的位置如何，通过InvYSP内胚层膜的转运机制与上述类似，都依赖于内体的pH值（图6）。因此，在NHP和人类中，含有Fc结构的分子的妊娠转运主要通过人类CAP进行，而在啮齿动物中则通过InvYSP进行。
IgG分子进入啮齿动物和兔子胚胎的转运途径：在啮齿动物和兔子中，IgG通过倒置卵黄囊胎盘进入胚胎。IgG最初存在于母体血液中，随后通过子宫分泌物进入胚胎体内，这些分泌物可能来自子宫腺体或子宫上皮细胞之间的渗漏。IgG与子宫分泌物一起被内吞到胚胎内层卵黄囊内胚层细胞的小泡中（1）。当溶酶体与小泡融合并释放溶酶体酶混合物时（2），小泡内的液体酸化，促进了IgG与小泡内FcRn受体的结合（3）。结合了FcRn的IgG受到保护，不会被溶酶体分解。当小泡与内层卵黄囊内胚层细胞的基底细胞膜融合时，其内容物被释放到胚胎组织的中性pH环境中。在中性pH条件下，IgG从FcRn受体释放并扩散到胎盘胚胎部分的毛细血管中（4）（DeSesso等人，2012年）经许可使用。含有Fc结构的分子与FcRn的高亲和力解释了它们相对于大多数小分子治疗药物的较长系统半衰期。药物开发者利用FcRn的结合亲和力，通过Fc突变来优化所需的半衰期和其他特性。此外，FcRn的结合特性与母体-胎儿转运之间存在关联，因为高亲和力的FcRn结合可以增加含有Fc结构的分子的跨细胞转运，而阻断FcRn结合则会抑制转运（Thorn等人，2012年；Zikos等人，2024年）；然而，结合动力学和其他影响IgG分布和消除的因素可能会改变这种关系（Datta-Mannan, Witcher, Tang, Watkins, Jiang, 和 Wroblewski 2007年；Datta-Mannan, Witcher, Tang, Watkins, 和 Wroblewski 2007年）。
1.6 FcRn的出现时间及其在胎盘转运中的作用
不同物种的妊娠期和含有Fc结构的分子的母体-胎儿转运程度各不相同（图7）（Bowman等人，2013年），这被认为受到转运部位的影响（如上所述）。尽管在植入前胚胎的1细胞阶段就已经检测到FcRn mRNA的表达，在2细胞和8细胞阶段的小鼠胚胎中表达水平更高（Warner和Paschetto 2000年），但目前尚不清楚这种胚胎表达是否会导致任何母体含有Fc结构的分子的转运。在啮齿动物中，InvYSP（倒置卵黄囊胎盘）在妊娠早期就形成了，并且大约在妊娠第9.5天开始转移含有Fc的分子（Roberts等人，1990年）；而在小鼠中则是在妊娠第7.5天开始（Jaffe等人，1990年；Kim等人，2009年）。这意味着在用于发育毒性测试的两种啮齿动物中，这种妊娠暴露途径在器官发生的大部分时间内都存在。体外实验也显示，豚鼠的FcRn能够结合并转运IgG（Xu等人，2015年），同时豚鼠母体与胎儿之间的IgG转移量也增加了。兔子中母体与胎儿之间IgG转移的主要途径也是通过InvYSP，该结构在妊娠第9-13天形成（Carney等人，2004年）。兔子的转移过程从妊娠第15天开始，并且随着妊娠的进展转移速率增加（DeSesso等人，2012年）。然而，与啮齿动物以及非人灵长类（NHP）和人类不同，兔子在妊娠第8天之前也会发生含有Fc的分子的早期转移，这发生在胚胎着床之前（表1），可能是通过不完整或破裂的紧密连接处扩散实现的（Pappenheimer，1990年；Pappenheimer和Reiss，1987年）。
图7：不同物种间妊娠时间以及含有Fc的生物分子母体-胎儿转移程度的比较。该图表概念性地展示了小鼠、大鼠、兔子、猕猴（cynomolgus）和人类妊娠期间的各种事件。妊娠期的长度（以天为单位）由灰色条形的长度表示。小鼠、大鼠和兔子的妊娠期明显短于猕猴和人类。大的矩形轮廓表示每个物种的器官发生期。条形内的绿色阴影表示含有Fc的生物分子通过胎盘转移的妊娠期。随着阴影加深，转移程度增加。需要注意的是，在小鼠、大鼠和兔子中，这些分子的转移发生在器官发生期间。而在其他物种中，转移开始于器官发生期之后（DeSesso等人，2012年），并参考了额外的数据（Bowman等人，2013年；Moffat等人，2014年）。含有Fc的分子转移的时间和程度与非人灵长类中的内源性母体IgG相似（Bowman等人，2013年；Pentsuk和van der Laan，2009年）。研究检测到NHP胚胎中存在FcRn和IgG，最早检测的时间为妊娠第35天（Catlin等人，2020年；Moffat等人，2014年）。由于NHP的主要器官发生期大约在妊娠第45天结束（表1），这些数据表明胚胎在这一关键器官发育期的后半段受到了暴露。之前关于胚胎最早暴露时间的估计受到数据缺乏的限制（Bowman等人，2013年），而不是因为转移不存在或检测限不够。未来的研究可能会调查更早期的胚胎，从而可能在妊娠更早阶段检测到暴露。基于这些有限的数据，关于这些分子的母体-胎儿转移机制仍有许多需要了解的地方。在人类中，直到妊娠第14周才检测到FcRn的表达（Israel等人，1993年）。与此一致的是，关于人类胎儿与母体IgG比例的现有信息显示，早在妊娠第17-22周时这一比例就已经为5%-10%。然而，Jauniaux等人（1995年）报告称，在妊娠第6-12周时，羊水中胎儿与母体的IgG比例为约3.5%，而Dancis等人（1961年）在妊娠第12周时发现的比例为2.8%。根据现有的（有限的）数据，包括来自NHP的数据，含有Fc的分子的母体-胎儿转移似乎在人类器官发生期的后半段开始。重要的是，（迷你）猪作为研究胎盘转运机制的模型并不理想，特别是IgG的转运，因为猪的胎盘中有多层母体组织，并且它们无法将IgG转运穿过胎盘（Hey等人，2020年；Jacobsen等人，2016年）。猪的胎盘是上皮绒毛膜类型的（Ramsey，1982年），这意味着母体血液不会接触到胎儿组织，尽管母体和胎儿血液之间有额外的组织层，但猪缺乏合胞滋养层（DeSesso，2024年）。尽管猪的合胞滋养层和小肠上皮中都存在FcRn（这可能允许胎儿通过吞咽的羊水接触到IgG），但在胎儿组织中并未检测到母体IgG（Jacobsen等人，2016年）。
2 材料与方法
以下文本提供了实验程序的概要。在撰写本手稿的过程中没有使用任何人工智能生成的内容工具。所有程序所用方法的详细信息可在支持信息中找到。表2列出了收集组织并分析样本的不同实验室。这些数据已在第56届畸形学学会年会上进行了展示（Breslin和Moffat，2016年）。
表2. 不同物种的组织收集与分析实验室。
2.1 动物组织的收集与处理
所有动物实验均获得了各机构动物护理和使用委员会的批准，并按照《实验室动物护理和使用指南》进行。每个设施都实施了批准的标准动物护理、饲养和环境条件（受控）。所有动物都提供了丰富的环境，如配对饲养、咀嚼玩具等。组织样本来自GSK（前身为GlaxoSmithKline）位于宾夕法尼亚州Collegeville的CD-1小鼠（n=25）、Sprague–Dawley大鼠（n=10）和新西兰白兔（n=12）；来自新泽西州新不伦瑞克市Bristol Myers Squibb公司的Hartley豚鼠（n=10）；以及来自内华达州Reno的Charles River Labs的cynomolgus猴子（n=3）。动物在妊娠期间的不同时间点被安乐死，从着床后不久开始直到预期分娩前不久结束。安乐死后立即从子宫中取出胚胎或胎儿。收集InvYSP和CAP组织，称重后放入不同的样品瓶中（组织样本被称重，但在某些情况下，这些不是完整的组织，例如InvYSP）。对于较年轻的胚胎，根据组织大小将组织按不同数量合并（例如，妊娠第13天的兔子InvYSP每瓶合并3或4个样本，妊娠第10天的兔子每瓶合并8到10个样本）。如果组织被合并，则记录了来源胚胎的数量。组织样本在收集后立即用PBS冲洗，放入干冰/乙醇浴中冷冻，并储存在设定为-70°C的冷冻柜中直至分析。如果分析地点不同于收集地点，则样本需用干冰运输。
2.2 动物体内FcRn蛋白的分析
2.2.1 小鼠、大鼠和兔子
冷冻的InvYSP和/或CAP组织样本解冻后，同一母体的两个组织样本被称重并合并后再进行匀浆。匀浆后的疏水膜部分被富集、消化，并加入重同位素标记的替代FcRn肽。选择这些肽是基于其独特性、化学稳定性、无分析干扰以及检测和定量的一致性。样品通过纳米液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）进行定量分析，以测定内源性FcRn肽和同位素标记的替代肽。大鼠的结果基于三种肽的平均浓度，小鼠基于两种肽的平均浓度，兔子基于一种肽的平均浓度。
2.2.2 豚鼠
收集并称重后的InvYSP和/或CAP组织样本（在≤70°C下储存前）被匀浆、消化，并提取肽，然后加入稳定同位素标记的替代FcRn肽进行定量，再通过LC–MS/MS进行分析。选择这些肽是基于其独特性、化学稳定性、无分析干扰以及检测和定量的一致性。样品分析重复进行两次。结果基于一种肽的平均浓度。
2.2.3 非人灵长类
解冻后，取大约50毫克湿重的组织样本（每个样本的湿重可能不同，但统一标准化为50毫克）。需要注意的是，胎盘的宏观形态差异使得难以确保使用等量的组织样本；每个NHP的样本进行了三次分析。疏水膜部分被富集、消化，并加入重同位素标记的替代FcRn肽进行定量。样品通过LC–MS/MS分析以测定内源性FcRn肽和同位素标记的替代肽的浓度。结果基于四种肽的平均浓度。
2.3 人类胎盘的收集、处理和FcRn分析
人类胎盘组织由汉密尔顿健康科学公司（Hamilton, ON）提供。所有程序均按照汉密尔顿健康科学综合研究伦理委员会批准的伦理协议（0269-T）进行。第一（n=6）和第二（n=5）孕期的胎盘组织来自选择性妊娠终止手术，以石蜡包埋块的形式提供。接近或足月（第三孕期）的胎盘样本（n=6）也以组织形式提供。所有样本在10% NBF中固定，然后进行石蜡包埋（也称为FFPE组织），并用于标准免疫组化染色。每个样本包括从人类胎盘中切下的大量组织，被认为是整个组织的代表。每个样本都评估了单个完整的大块组织（见图S1，了解不同孕期的代表性切片）。样本被唯一标识，所有患者特征均被隐藏。FFPE组织块切成5微米厚的切片，安装在预清洗过的玻璃载玻片上，并进行免疫组化（IHC）。用于分析FcRn表达和细胞定位的抗体包括FcRn（Sigma，HPA 012122，兔多克隆IgG，0.5 mg/mL）、CD31/PECAM1（Santa Cruz，M-20山羊多克隆，0.5 mg/mL）、IBA1（Wako，Cat# 019-19741，兔多克隆，0.05 mg/mL）和人类IgG（Leica Microsystems，Novocastra，RWP49，0.3 mg/mL）。切片被数字扫描，图像以高分辨率tiff文件的形式保存。病理学家根据胎盘内特定细胞类型中的免疫组化染色情况评估FcRn的表达。每种细胞类型的二元评分计算为每个孕期样本总数的百分比。数据使用GraphPad Prism 7软件进行整理和绘图。
3 结果
为了了解在常用于胚胎-胎儿发育测试的动物物种中，妊娠期间含有Fc的分子可能的转移情况，通过定量质谱法测量了小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和非人灵长类（NHP）中的FcRn蛋白浓度。FcRn蛋白浓度以pmol/mg的组织重量表示（见图8和图9）。图8和图9中标明了组别大小和样本处理方式（即是否由于组织有限而单独或合并）。这是一个高度协作的过程，有两个实验室负责组织收集，三个实验室负责样本分析。尽可能采用了可比的方法，但在LC–MS–MS技术的应用上存在一些差异。数据经过仔细整理，并以每单位组织重量的浓度形式呈现。值得注意的是，不同物种之间的FcRn蛋白浓度（pmol/mg组织）确实存在一些差异，但在妊娠时间和组织类型之间的趋势是明显的。FcRn蛋白浓度是基于大鼠三种肽的平均浓度以及小鼠两种肽的平均浓度得出的。向上的误差条代表CAP值的一个标准差，向下的误差条代表InvYSP值的一个标准差。由于名义蛋白浓度值的预期变异性，Y轴的范围因物种而异。图9可以在图形查看器中打开。
不同妊娠阶段的兔子、豚鼠和非人灵长类动物的倒置卵黄囊胎盘（InvYSP）和/或绒毛尿囊胎盘（CAP）组织中的FcRn蛋白浓度通过定量质谱法测量得到。FcRn蛋白浓度以堆叠条形图的形式呈现，CAP的值位于InvYSP值之上。每个妊娠日分析的样本数量分别标示在相应的条形图上方；第一个数字代表InvYSP的样本数量，第二个数字代表CAP的样本数量；如果只显示一个数字，则表示InvYSP和CAP分析的样本数量相同。“#”表示混合组织。FcRn蛋白浓度结果基于非人灵长类动物四种肽的平均浓度，而兔子和豚鼠的数据来自一种肽。向上的误差条代表CAP值的一个标准差，向下的误差条代表InvYSP值的一个标准差。由于名义蛋白浓度值的预期变异性，Y轴的范围因物种而异。在小鼠中（图8A），从妊娠第8天到第10天，InvYSP中的FcRn浓度显著增加（增加了380倍）。随后，在妊娠第12天、第14天、第16天和第18天，InvYSP中的FcRn浓度分别增加了1.8倍、2.1倍、2.7倍和2.7倍。对于小鼠的CAP，从妊娠第8天到第10天，FcRn浓度增加了7倍，但之后基本保持不变；其浓度范围从妊娠第10天的0.58倍增加到0.81倍。在大鼠中（图8B），随着妊娠的进展，InvYSP中的FcRn浓度持续显著增加；从妊娠第10天到第13天分别增加了6倍、21倍、38倍和37倍。相反，CAP的浓度在胎盘发育期间最初有所增加，但从妊娠第13天后基本保持稳定；从妊娠第10天到第13天增加了37倍，但从妊娠第16天到第21天略有变化，范围在0.60倍到0.98倍之间。在妊娠第19天和第21天，两种组织的浓度没有显著差异。在兔子中（图9A），从妊娠第10天开始，InvYSP中的FcRn浓度持续增加；在器官发生期间，浓度分别从妊娠第13天增加了5倍、9倍和22倍，然后在妊娠第24天和第29天分别增加了50倍和71倍。器官发生后的FcRn浓度是器官发生期间的10倍。对于兔子的CAP浓度，在所有测量时间点上变化都很小，且随着妊娠的进展有轻微上升趋势；妊娠第13天的浓度分别是妊娠第10天的0.67倍、1.1倍、1.9倍、2.3倍和2.0倍。在豚鼠中（图9B），早期器官发生阶段没有样本收集，第一个测量时间点是妊娠第15天。对于豚鼠的InvYSP中的FcRn浓度，有一个明显的上升趋势，从妊娠第21天到第30天分别增加了8.6倍、24倍、62倍、40倍。对于豚鼠的CAP浓度，整个妊娠期间的增加趋势较为平缓；从妊娠第21天到第30天分别增加了2.5倍、6.4倍、10倍和13倍。在非人灵长类动物中（图9C），第一次样本收集是在妊娠第35天的器官发生中期，且只收集了CAP。从妊娠中期到妊娠末期（妊娠第135天），任何测量时间点上的CAP中FcRn浓度都没有显著差异；与妊娠第35天相比，妊娠第50天、第70天、第100天和第135天的浓度分别是0.94倍、1.3倍、0.85倍和1.0倍。总体而言，所有动物物种的胎盘组织（InvYSP和/或CAP）在整个妊娠期间（包括器官发生期间）都检测到了FcRn蛋白，且随着妊娠的进展，其浓度呈上升趋势，非人灵长类动物除外。即使在最早的时间点，也能在所有可收集的InvYSP组织中检测到FcRn蛋白，并且所有物种中InvYSP中的FcRn蛋白水平每毫克组织的含量都高于CAP（非人灵长类动物中没有InvYSP）。在所有测试的物种中（包括非人灵长类动物），CAP中的浓度都很低，并且在所有妊娠阶段都基本保持不变。这一点在兔子、豚鼠和非人灵长类动物中尤为明显，因为它们的妊娠期远远超过了器官发生期。
3.2 人类胎盘FcRn免疫组化
为了了解妊娠期间Fc含分子跨胎盘膜的潜在转移情况，使用IHC评估了人类IgG和FcRn的表达。在足月胎盘中检测到人类抗体（总IgG）（图10A,B），显示母体窦道（A，绿色星号）和胎儿血管（B，星号）中存在丰富的IgG，以及合胞滋养层细胞（A，箭头）和胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）（B，箭头）对其的摄取。图10可以在图形查看器中打开。
在足月胎盘的多个区域进行了人类IgG免疫组化检测。在母体血液窦道（绿色*）、胎儿合胞滋养层细胞（箭头）、胎儿血管（星号）和胎儿绒毛膜巨噬细胞（Hofbauer细胞，箭头）中检测到IgG。主要表达FcRn的细胞类型是合胞滋养层细胞（图11A）、内皮细胞（图11B）和巨噬细胞（Hofbauer细胞）（图11C）。在妊娠的第一孕期，6个样本中的所有样本（100%）的胎盘胎儿部分都由胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）表达了FcRn（图11D），偶尔也在胎儿毛细血管内皮细胞（2/6个样本，33%）（图11G，星号）和胎儿合胞滋养层细胞（3/6，50%）中表达。在胎盘的母体部分，FcRn由母体巨噬细胞（6/6，100%）、蜕膜（5/5，100%）和母体内皮（4/5，80%）表达。图11可以在图形查看器中打开。
人类胎盘绒毛膜 villi 的免疫组化：(A) 合胞滋养层细胞中的FcRn；(B) CD31+ 胎儿血管；(C) IBA1+ 胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）。来自妊娠第一（D, G）、第二（E, H）和第三（F, I）孕期的胎盘绒毛膜 villi 的FcRn免疫组化。(D) 第一孕期胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）中的FcRn表达；(E) 第二孕期合胞滋养层细胞（箭头）和小血管内皮细胞（星号）中的FcRn表达。(F) 第三孕期，大多数血管内皮细胞（星号）中的FcRn上调。(G) 第一孕期偶尔在胎儿毛细血管（星号）中的FcRn表达；(H) 第二孕期中等大小血管中的FcRn阳性内皮（星号）；(I) 第三孕期绒毛干中的中等和大型血管中的FcRn阳性内皮（星号）。在第二孕期的胎盘胎儿部分，所有样本中的胎儿巨噬细胞（5/5，100%）都表达了FcRn（图11E），合胞滋养层细胞和细胞滋养层细胞（5/5，100%）（图11E箭头），毛细血管内皮细胞（5/5，100%）（图11E，星号），以及大型胎儿血管的内皮（5/5，100%）（图11H，星号）。在胎盘的母体部分，FcRn由母体巨噬细胞（5/5，100%）、蜕膜（5/5，100%）和母体内皮（5/5，80%）表达（未显示）。在第三孕期的胎盘胎儿部分，表达FcRn的细胞类型分布相似，但染色强度增加，并且在所有样本中的胎儿巨噬细胞（6/6，100%）（图11F）、胎儿合胞滋养层细胞（6/6，100%）（胎儿细胞滋养层细胞不再存在）、胎儿毛细血管内皮细胞（6/6，100%）和大型胎儿血管的内皮（6/6，100%）（图11I）中观察到。在妊娠第19天和第21天，两种组织的浓度没有显著差异。在妊娠第10天后，InvYSP中的FcRn浓度在整个器官发生期间持续增加，之后增加更为显著；在器官发生期间，浓度分别从妊娠第13天的5倍、9倍和22倍增加到妊娠第24天的50倍和第29天的71倍。器官发生后的FcRn浓度是器官发生期间的10倍。对于兔子的CAP浓度，在所有测量时间点上变化都非常小，随着妊娠的进展有轻微上升趋势；妊娠第13天的浓度分别是妊娠第10天的0.67倍、1.1倍、1.9倍、2.3倍和2.0倍。在豚鼠中（图9B），早期器官发生阶段没有样本收集，第一个测量时间点是妊娠第15天。对于豚鼠的InvYSP中的FcRn浓度，有一个明显的上升趋势，从妊娠第21天到第30天分别增加了8.6倍、24倍、62倍、40倍。对于豚鼠的CAP浓度，整个妊娠期间的增加趋势较为平缓；从妊娠第21天到第30天分别增加了2.5倍、6.4倍、10倍和13倍。在非人灵长类动物中（图9C），第一次样本收集是在妊娠第35天的器官发生中期，且只收集了CAP。从妊娠中期到妊娠末期（妊娠第135天），在任何测量时间点上CAP中的FcRn浓度都没有显著差异；与妊娠第35天相比，妊娠第50天、第70天、第100天和第135天的浓度分别是0.94倍、1.3倍、0.85倍和1.0倍。总体而言，所有动物物种的胎盘组织（InvYSP和/或CAP）在整个妊娠期间（包括器官发生期间）都检测到了FcRn蛋白，且随着妊娠的进展，其浓度呈上升趋势，非人灵长类动物除外。即使在最早的时间点，也能在所有可收集的InvYSP组织中检测到FcRn蛋白，并且所有物种中InvYSP中的FcRn蛋白水平每毫克组织的含量都高于CAP（非人灵长类动物中没有InvYSP）。在所有测试的物种中（包括非人灵长类动物），CAP中的浓度都很低，并且在所有妊娠阶段都基本保持不变。这一点在兔子、豚鼠和非人灵长类动物中尤为明显，因为它们的妊娠期远远超过了器官发生期。
4 讨论
4.1 动物InvYSP和CAP中的FcRn蛋白浓度
了解不同物种妊娠期间InvYSP和CAP中FcRn浓度的发生过程对于理解胎儿暴露于含Fc的生物制药产品以及人类风险评估至关重要。随着美国和欧洲卫生当局宣布减少临床前安全研究中的动物实验的计划，这里生成的数据最终可能有助于使用计算机建模来预测含Fc分子的胎盘转移，这些模型基于FcRn的表达水平及其与受体的结合亲和力。在小鼠中，InvYSP中的FcRn浓度明显高于CAP，平均约为25倍（范围从9倍到41倍）。这与通过原位杂交（Jaffe等人，1990年）和IHC（Latvala等人，2017年）在小鼠InvYSP内皮细胞中检测到FcRn的结果一致。在大鼠中，InvYSP中的FcRn蛋白浓度明显高于CAP（平均高出约10倍，妊娠第13天除外；图8B）。这与通过IHC检测到的结果一致，即在妊娠第15天，InvYSP内皮层中的FcRn染色强烈且显著，而在迷宫区和绒毛膜板中的染色较弱（Martinez等人，2020年）。在其他研究中也报道了在CAP的迷宫区的内皮细胞和内皮层中检测到FcRn，这与小鼠的结果一致（Latvala等人，2017年）。InvYSP的内皮层直接面对胎儿循环系统。这种内皮中的FcRn表达可能负责将母体IgG转运穿过卵黄囊壁进入胎儿循环系统。除了胎盘中的FcRn用于胎儿期的母体-胎儿转移外，啮齿动物还有一条额外的产后转移途径，这可能是由于它们的妊娠期较短。出生时，啮齿动物的胃肠道尚未成熟（DeSesso，2022年），胃分泌物呈中性（pH 7–7.5），在断奶前缺乏消化酶（Walthall等人，2005年）。新生儿的肠上皮在形态和功能上与成熟的成年上皮不同（Carlile和Beck，1983年；Picut和Parker，2017年），主要依靠胞饮作用进行吸收。IgG和其他含Fc分子的吸收是由不成熟近端小肠的内皮细胞中的FcRn介导的（Arevalo Sureda等人，2016年；Cooper等人，2014年；Israel等人，1997年）。在回肠的上皮细胞中，营养素和其他大分子的非选择性胞饮作用发生，这些细胞缺乏FcRn受体。在兔子中，器官发生期间的CAP中FcRn浓度可以忽略不计，妊娠后期相对较低。从妊娠第13天开始，InvYSP中的FcRn浓度可以检测到，并在器官发生期间和妊娠结束后增加了13倍（图9A）。尽管之前有报道在妊娠末期检测到兔子InvYSP中的FcRn（Cobbs Jr.等人，1980年；Liteplo等人，1982年），但这是首次报道在器官发生期间检测到FcRn，这与卵黄囊反转后（妊娠第9–13天）IgG的胎盘转移一致，此时Reichert膜降解完成，InvYSP膜与子宫上皮紧密接触（Carney等人，2004年；Smith和Schechtman，1962年）。关于FcRn结合IgG的现有数据支持FcRn在兔子中参与母体-胎儿转移的作用（Catunda Lemos等人，2012年；Szikora等人，2017年），因此，这一物种在评估妊娠期间含Fc生物制药的安全性方面具有相关性。在豚鼠的InvYSP中，FcRn浓度明显高于CAP，从妊娠第15天到第60天增加了约40倍，而CAP在同一时期增加了13倍（图9B）。在妊娠第15天（GD 15）检测到的FcRn表达表明，某些单克隆抗体（mAb）可能通过胚胎发生早期阶段以及InvYSP和CAP两种途径转移到胚胎中。CAP和InvYSP中的FcRn表达与所有时间点上IgG和含Fc分子的胎盘转移一致（Barnes 1959；Leissring和Anderson 1961；Ma等人2014；Struble等人2012；Xu等人2015）。与小鼠、大鼠、兔子和豚鼠不同，新世界猴（NHP）的胎盘FcRn蛋白浓度在妊娠期间并未增加（NHP没有InvYSP）。然而，与其他物种类似，在最早检测的时间点（NHP的妊娠第35天），CAP中已经检测到FcRn蛋白，这正是主要器官发生期，但比其他物种的检测时间要早。尽管如此，FcRn蛋白浓度在整个妊娠期间保持稳定（图9C）。这与Western Blot检测结果一致，即NHP CAP在妊娠第35天就已经存在FcRn，并且在整个妊娠期间表达水平相似（Catlin等人2020），也与通过IHC染色在妊娠第150天在胎盘绒毛的合胞滋养层和胎儿血管内皮细胞中检测到的FcRn结果一致（Latvala等人2017）。此前，Latvala等人（2017）发表了IHC数据，显示在小鼠、大鼠和NHP的妊娠后期存在胎盘FcRn，但未对其数量进行量化。据我们所知，当前研究的数据是首次量化这些物种妊娠早期InvYSP和/或CAP中FcRn浓度的数据。这些数据存在一些局限性，因为由于用于量化FcRn肽的方法略有不同，无法直接进行物种间的比较。尽管如此，同一物种内CAP和InvYSP之间的FcRn浓度比较是定量的。即使有这些局限性，数据仍然显示出一些共同特征：在小鼠、大鼠、兔子和豚鼠中，InvYSP是FcRn浓度的主要来源，并且随着妊娠的进展，其浓度会增加。在本研究中，所有动物物种的胎盘组织（InvYSP和/或CAP）在整个妊娠期间（包括器官发生期）都检测到了FcRn蛋白，且其浓度呈上升趋势，NHP除外。即使在最早的时间点，也能在所有可收集的InvYSP组织中检测到FcRn蛋白，并且所有物种中InvYSP的FcRn蛋白水平都比CAP高得多（NHP没有InvYSP）。这种InvYSP中FcRn蛋白浓度较高的现象在整个妊娠期间都存在，并且随着妊娠的进展和CAP功能的增强而持续。在所有测试的物种中，CAP中的FcRn浓度都很低，并且在所有妊娠阶段都基本保持不变。这一点在兔子、豚鼠和NHP中尤为明显，因为它们的妊娠期超过了器官发生期。这些数据表明，在小鼠、大鼠、兔子和豚鼠中，InvYSP在整个妊娠期间一直是FcRn介导的分子转移的重要组织。在本研究中，测量的是FcRn蛋白的浓度，而不是总FcRn蛋白或通过FcRn的含Fc分子的功能性跨细胞转运（因为蛋白质的存在并不直接等同于IgG的母体-胎儿转移能力）。此外，报告的CAP和InvYSP FcRn浓度数据在某些情况下是基于混合组织（例如，妊娠早期的啮齿动物InvYSP）或代表性部分（妊娠后期的NHP CAP）的，因此无法按整个组织重量进行标准化。尽管如此，已知胎盘在妊娠期间会迅速增大。基于此，可以合理预期总FcRn蛋白在整个妊娠期间会增加（即使在CAP中，FcRn蛋白浓度基本保持不变）。因此，随着妊娠的进展和胚胎-胎儿暴露的增加，转移的含Fc分子的比例也可能增加。在某些情况下，FcRn蛋白表达与含Fc分子的转移和胚胎暴露之间的相关性可能并不直接。有数据表明，当受体基因由不同的启动子控制时，InvYSP胎盘中的FcRn表达模式和水平可能会改变，如在表达人类FcRn的转基因小鼠中所显示的（Latvala等人2017）。含Fc蛋白的其他特性，如它们的四级结构（Brinkhaus等人2022）、糖基化模式（Jennewein等人2019；Saunders 2019；Volkov等人2023）、点突变、IgG亚类和物种（Szikora等人2017；Vaccaro等人2006）也会影响它们与FcRn的结合亲和力，从而影响跨胎盘转运。
4.2 人类胎盘中的FcRn
在人类胎盘中，FcRn在胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）中持续表达。胎盘胎儿部分其他细胞中的FcRn表达在第二孕期增加；合胞滋养层中的FcRn表达在第一孕期较少，在第二和第三孕期显著增加（图12）。胎儿血管内皮细胞中的FcRn表达在第一孕期很少见，但在第二孕期在小型和大型胎儿血管中增加，并在第三孕期保持高水平（图12）。在胎盘母体部分，FcRn在内皮细胞中的表达在第二孕期达到峰值，在第三孕期下降。蜕膜和母体胎盘巨噬细胞与胎儿巨噬细胞一样，在整个妊娠期间都表达FcRn。这些数据表明，在第二孕期，合胞滋养层和胎儿血管中的FcRn表达显著增加，这促进了母体IgG以及含Fc分子向发育中的胎儿的转移。观察到的FcRn在血管中的表达增加支持了已发表的报告，即在主要器官发生期（第一孕期）胎儿接触IgG的量比第二孕期少。一个有趣的观察是，在整个妊娠期间，胎儿和母体巨噬细胞中都存在大量的FcRn。这些胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）还表达其他Fc受体，包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII（Jensen和Matre 1995；Kiskova等人2019；Saji等人1999）。虽然超出了本研究的范围，但胎儿毛细血管表达FcγRIIb，这也可能在含Fc分子的转移中起作用。先前研究调查了人类胎盘中的FcRn定位，结果各不相同。在所有孕期，FcRn在合胞滋养层（Kiskova等人2019；Latvala等人2017；Leach等人1996；Simister等人1996）和胎儿血管内皮细胞（Kiskova等人2019；Latvala等人2017；Leach等人1996；Radulescu等人2004）中都持续检测到。两项研究在检查足月胎盘时也观察到了与巨噬细胞表达一致的结果（Kiskova等人2019；Leach等人1996）。值得注意的是，在唯一一项评估第二孕期胎盘的研究中未观察到滋养层细胞的表达（Latvala等人2017）。据我们所知，本研究是首次系统地分析所有孕期胎儿和母体胎盘组织中的FcRn表达。
4.3 FcRn与含Fc分子的胎盘转移
迄今为止，关于胎盘转移含Fc分子的信息主要依赖于测量这些分子在胚胎-胎儿中的浓度。这些数据在不同物种之间可能存在很大差异，包括小鼠、大鼠、兔子、新世界猴（NHP）和人类；特别是在母体浓度方面（Bowman等人2013）。特定物种的数据包括小鼠（Brambell 1970；Kim等人2009）、大鼠（Bowman等人2012；Coder等人2013；Halliday 1955；Thorn等人2012）、兔子（Brambell 1970；Carney等人2004）、豚鼠（Struble等人2012；Xu等人2015）、NHP（Catlin等人2020；Moffat等人2014；Wang等人2016）和人类（Dancis等人1961；Jauniaux和Gulbis 2000；Jauniaux等人1995；Malek等人1996）。这些数据在妊娠早期的器官发生期非常有限，这可能是由于样本收集的挑战。为了更好地理解整个妊娠期间含Fc分子的胎盘转移，我们采用了评估不同物种间胎盘FcRn发育过程的正交方法。根据本研究的数据，小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和NHP中的FcRn蛋白浓度与现有的关于含Fc分子胎盘转移的数据一致（Bowman等人2013），即除了NHP外，所有测试的动物物种中FcRn蛋白浓度都随着妊娠的进展而增加，尽管预计随着胎盘大小的增加，所有物种的总胎盘FcRn也会增加。此外，器官发生期间FcRn的存在与有限的数据一致，表明即使在非常少量的情况下，也发生了含Fc分子的转移。我们的数据表明，在小鼠、大鼠、兔子和豚鼠中，InvYSP在器官发生期间具有可测量的FcRn蛋白。观察到随着妊娠的进展，FcRn蛋白浓度增加，这是一个强有力的指标，表明InvYSP参与了小鼠、大鼠、兔子和豚鼠整个妊娠期间含Fc分子的胎盘转移。此外，NHP和人类CAP在整个妊娠期间，包括第一孕期，都存在FcRn，这支持了含Fc分子能够早期进行母体-胎儿转移的类似假设。如前所述，虽然NHP和人类的FcRn浓度可能在整个妊娠期间不会增加，但灵长类动物CAP的快速生长与妊娠期间含Fc分子转移的增加是一致的。
4.4 FcRn——并非全部故事
FcRn在IgG转运中的重要性是不可否认的，因为缺乏FcRn的敲除小鼠无法转移IgG（Kim等人2009），以及缺乏Fc部分的Fab片段或IgG的Fc片段发生突变而无法与FcRn结合，因此不能穿过胎盘（Thorn等人2012；Wakefield等人2011）。虽然这些数据和其他上述信息表明了对某些大分子母体-胎儿转移现象的部分理解，但我们对整个转运蛋白库和动力学的了解仍然很初步，但仍在不断发展（Albrecht等人2019；Ilekis等人2016）。当然，大于500 Da的非IgG分子，如胆红素（585 Da）和万古霉素（1449 Da）可以穿过胎盘。还有其他胎盘蛋白，包括胎盘碱性磷酸酶和annexin II，它们可以结合含Fc分子，尽管尚未确定它们在胎盘转移中的作用（Kristoffersen 1996；Simister和Story 1997）。越来越清楚的是，FcRn是母体-胎儿转移大分子的主要机制，但它可能不是唯一的参与者。关于开发用于优化妊娠期间疫苗接种计划的计算机模拟胎盘模型的有趣数据也被提出（Wessel和Dolatshahi 2023）。他们指出了关于FcRn在合胞滋养层中的作用以及Fc-γ-III受体在内皮细胞中的作用存在的争议。Fc-γ受体已在胎盘中被描述（Kameda等人1991），其他人建议它们可能有助于增强Fc分子的跨胎盘转运（Jennewein等人2019）。最近的研究还表明，恒河猴中可能需要额外的Fcγ受体来完成IgG的胎盘转移（Rosenberg等人2023）。此外，还有研究表明，尽管胎盘转运是由FcRn驱动的，但Fc-γ-III受体的糖基化可能会调节转运速率（Borghi等人2020）。还需要研究其他转运途径和模式，包括未识别的转运蛋白以及合胞板中可能存在的间隙。进一步来说，人们可能会问是否在合胞滋养层中会出现暂时的孔洞或其他开口。了解含Fc分子的母体-胎儿转移的时间以及识别穿越胎盘的替代途径应该是研究这些分子安全性的重点。
4.5 对风险评估的影响
虽然认识到含Fc分子转移的主要部位在小鼠和兔子中是InvYSP而在灵长类动物中是CAP很重要，但从风险评估的角度来看，根据文献中的现有数据和这里呈现的胎盘FcRn表达数据，含Fc分子在妊娠的关键时期可以进入啮齿动物、兔子和灵长类动物的胚胎。FcRn被认为是将含Fc分子转移到后代的主要机制，因此所有物种在妊娠所有阶段（包括器官发生期）都存在FcRn表达，这支持了使用非临床模型来识别含Fc生物制剂的危害的相关性（Bowman等人2013）。如前所述，可能存在其他转运受体或机制，以及其他修饰/调节因子，因此FcRn表达与母体-胎儿转移含Fc分子之间不一定总是存在一对一的关系。例如，观察发现Fc融合蛋白与人类FcRn的亲和力较低，且半衰期比单克隆抗体（mAbs）更短（Berthelsen等人，2010年；Suzuki等人，2010年），这可能导致其在胎盘中的转移效率较低（Murashima等人，2009年）。因此，尽管还需要进一步的研究来完全了解含Fc的生物治疗药物如何以及何时能够进入发育中的胚胎，但现有的非临床动物模型提供了有意义的数据，有助于进行人类风险评估。为了更好地利用动物数据进行人类风险评估，应考虑任何相关的物种特异性差异。其中一个物种特异性特征是动物物种与人类之间的FcRn结合特性（Ober等人，2001年）；在基于动物数据评估含Fc治疗药物的人类风险时，这些差异可能非常重要。例如，小鼠的FcRn结合特异性比人类的FcRn要广泛得多（Rodewald，1976年；Zhou等人，2003年）。此外，小鼠模型中的FcRn结合特异性与人类FcRn也存在显著差异（Vaccaro等人，2006年）。如前所述，与妊娠期较长的物种不同，小鼠和大鼠在哺乳期间也会通过胎盘中的FcRn将含Fc的分子从母体乳汁传递给后代。与其他上述动物物种一样，豚鼠也是一个很好的模型，因为固定在固体表面的豚鼠FcRn可以结合人类IgG和豚鼠IgG，这使得豚鼠成为评估含Fc分子胎盘转移的相关模型。所有工程化的人类Fc同型特异性构建体在体外都能被表达豚鼠FcRn的细胞内化（Xu等人，2015年）。
5 结论
我们回顾了相关实验室物种与人类之间的胎盘形成差异，并研究了胎盘FcRn的分布位置、发生过程及其浓度，以提供更多关于妊娠期间母体IgG和含Fc生物制药向后代转移/生物分布的背景信息，从而为发育毒性测试提供依据。随着妊娠的进展，InvYSP（胚胎-胎儿交界带）和CAP（绒毛膜下腔）中FcRn的存在和/或浓度增加（预计胎盘表面积也会增加），表明胚胎和胎儿在整个妊娠期间都可能接触到含Fc的分子，包括在主要器官形成期间。在妊娠期较短的物种（如小鼠、大鼠、豚鼠和兔子）中，FcRn主要存在于InvYSP中，而在NHP（新世界猴）和人类（不发育InvYSP）中，FcRn仅存在于CAP中。无论FcRn的位置如何，所有物种中的含Fc分子都可以在妊娠期间进入胚胎，尽管转移的程度取决于FcRn的表达水平和胎盘的大小。因此，尽管不同物种之间FcRn的位置存在差异，但所有物种的胚胎在妊娠期间都会接触到含Fc的分子。尽管关于胎盘FcRn和含Fc分子生物分布的跨物种信息越来越多，但这一过程的一般药代动力学和动态机制尚未完全明了，孕妇和胎儿可能存在特定的安全性和有效性特征。理解和解决这些空白也有助于更好地模拟含Fc分子的胎盘转移。未来解决这些空白将有助于改进临床实践和治疗妊娠相关疾病的策略。
致谢
作者感谢Graeme Moffat（Amgen）、Rogely Boyce（Amgen）、Kristin Juruski（GSK）、John Kellie（GSK）、Teresita Olitan和Eugene Ciccimaro（BMS）、Alexandra Taraboletti和Shermaine Mitchell-Ryan（HESI）以及来自AbbVie、BMS、Celgene、GSK、Hamilton Health Sciences（麦克马斯特大学）和MSBioworks的其他人员的支持。
资金支持
这项HESI科学计划主要由公共和私营部门参与者提供的时间、专业知识和实验工作的实物贡献支持。具体资金来自AbbVie、Amgen、BMS、Celgene、GSK和Hamilton Health Sciences（麦克马斯特大学）。
利益冲突
C. J. Bowman、J. M. DeSesso、W. J. Breslin、J. Hui、S. Laffan、M. Myers、L. Sivaraman和S. Westmoreland受雇于制药行业或为制药行业提供咨询，这已在他们的隶属关系中说明。作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
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