吕玉洁|黄伟晨|葛朝阳|吴连琪|胡照英|詹世娜|沈新宇|于东友|刘冰
中国浙江大学海南研究院，三亚572000
**摘要**
研究表明，聚苯乙烯微塑料（PS）对环境的污染会引发动物体内的炎症反应，并损害其生殖功能。木兰醇（MAG）是一种具有抗炎特性的天然化合物。然而，MAG对PS引起的输卵管损伤的保护作用尚不明确。本研究旨在探讨在暴露于PS的环境中，通过饮食补充MAG对产蛋鸡的保护效果及其潜在机制。共有270只海兰白鸡被随机分为三组：对照组（CK）、PS暴露组（PS）和MAG保护组（PM）。PM组的鸡被喂食添加了MAG的饲料，而CK组和PS组的鸡则喂食基础饲料。经过8周的饮食处理后，PS组和PM组的鸡通过灌胃方式接受了1 mg/mL的PS处理，而CK组则接受了磷酸盐缓冲盐水处理，持续4周。结果表明，PS暴露显著降低了卵白质量和蛋壳强度，这与有益细菌乳酸杆菌数量的减少、黏膜屏障完整性的破坏、氧化应激的增加以及输卵管内的炎症和细胞凋亡有关。MAG的补充通过改善抗氧化状态、减轻黏膜炎症和细胞凋亡、增强上皮屏障标志物以及恢复输卵管内的微生物平衡，缓解了这些不良影响。体外细胞培养实验也证实，MAG可以通过抑制NF-κB信号通路的激活来抑制巨噬细胞的M1型极化。因此，MAG减少了黏膜炎症和细胞凋亡，增强了上皮屏障标志物（Claudin和MUC-2）的表达，并恢复了输卵管内的微生物平衡。这些发现表明，MAG通过免疫调节和微生物群调节作用，减轻了PS引起的输卵管损伤，最终提高了产蛋鸡的生殖性能。本研究强调了MAG作为一种有前景的饮食策略，可用于对抗由微塑料引起的家禽生殖毒性。
**引言**
聚苯乙烯微塑料（PS）是最常见的塑料材料之一。PS可以被食物植物和牲畜吸收并积累，带来多种环境和生物学风险（Auneer Ahmad, 2023; Aziz et al., 2021; Matsumoto et al., 2023; Senathirajah et al., 2021）。越来越多的证据表明，PS颗粒可以通过氧化应激和炎症相关机制引发多器官毒性。在鸡体内，PS暴露已被报道会通过内质网应激相关的NLRP3炎性体激活途径引发肺部炎症（Lu, H. et al., 2024）。在水生细胞中，PS微粒可以促进ROS的积累，导致细胞周期停滞、细胞凋亡和自噬（Lu, Hongmin et al., 2024）。此外，PS微粒还被证明可以通过诱导巨噬细胞形成细胞外陷阱来促进肝脏炎症（Yin et al., 2023a）。这些发现表明，氧化应激、炎症激活和免疫细胞功能障碍是PS毒性作用的核心病理事件。在整个产蛋周期中，产蛋鸡持续暴露于各种PS衍生材料中，包括饲料袋、笼子和水管，这些是微塑料污染的持续来源（Wu et al., 2021）。有研究表明，微塑料会对鸡的睾丸组织造成严重损害，并引发氧化应激和炎症细胞浸润。然而，关于PS对雌性家禽输卵管结构、黏膜免疫和产蛋能力影响的研究仍然非常有限，这突显了迫切需要评估这些影响。
雌性家禽的生殖道并非胚胎发育的场所，而是卵子各部分形成的场所，包括卵黄（卵巢）、卵白（卵黄囊）、蛋壳膜（峡部）和蛋壳（子宫）（Wen et al., 2021）。为了维持输卵管健康并确保高质量的产蛋，一个完整的黏膜屏障——包括紧密连接、黏液、免疫细胞和正常的细菌群落——是必不可少的（Wang et al., 2016）。有研究表明，生殖道的微生物群对产蛋量的影响大于消化道微生物群的影响（Su et al., 2021b）。同时，巨噬细胞是生殖功能的重要辅助细胞，在雄性和雌性的生殖道中都大量存在（Cohen et al., 1999）。在环境压力下，PS颗粒可以被巨噬细胞内化，在溶酶体中积累并引发氧化应激和炎症应激（Das, 2023; Jasinski et al., 2023）。这种破坏会促进巨噬细胞的经典极化（M1型极化），导致通过NF-κB和MAPK通路大量分泌促炎细胞因子（如IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6）（Hegarty et al., 2023; Liu et al., 2014; Pan et al., 2022）。在慢性输卵管炎中，这些浸润的M1型巨噬细胞会加剧黏膜屏障损伤和组织重塑。因此，调节输卵管微生物群组成和巨噬细胞极化是防止PS引起的黏膜损伤的关键策略（Wang et al., 2020; Liao et al., 2024）。
木兰醇（MAG）是从木兰树根和树皮中提取的一种羟基苯衍生物（Borgonetti et al., 2021），由于其广泛的药理作用和强大的抗炎活性（Sarrica et al., 2018; Wijesuriya and Lappas, 2018），被用作膳食补充剂。体外研究表明，MAG可以抑制NF-κB p65亚单位的核转位和磷酸化，从而抑制NF-κB信号通路的激活并发挥抗炎作用（Tse et al., 2007）。此外，体内研究表明，MAG通过激活过氧化物酶体增殖激活受体γ来调节巨噬细胞极化，并调节M1标志基因的表达，从而缓解饮食引起的非酒精性脂肪性肝炎（Zhong and Liu, 2018）。在家禽生产中，膳食补充是这类功能性添加剂的最佳给药途径。我们最近的体内剂量优化研究评估了不同剂量（200、400和600 mg/kg）的MAG对产蛋鸡的影响（Lv et al., 2024）。结果表明，400 mg/kg的剂量在缓解黏膜屏障损伤和调节局部免疫反应方面达到了最佳效果，且没有不良反应。基于其已证实的黏膜保护作用和确定的安全部剂量，我们假设在这一优化剂量（400 mg/kg）下，MAG同样可以对输卵管黏膜起到保护作用，对抗微塑料引起的毒性。因此，本研究旨在系统探讨饮食补充MAG对PS引起的输卵管损伤、产蛋性能下降和炎症反应的影响及其潜在机制，特别关注巨噬细胞极化和输卵管微生物群的调节。
**材料与方法**
聚苯乙烯微塑料（PS）购自上海麦克林生化有限公司（中国上海；商品编号9003-53-6）。储备悬浮液的浓度为2.5% w/v。为了确保实验材料的准确性，使用扫描电子显微镜（SEM）验证了其形态特征和粒径（图S1A）。这些颗粒呈球形，具有高单分散性，平均粒径为75.50 ± 5.38 nm（N = 65）。根据其纳米级尺寸，本研究中使用的PS颗粒被称为纳米级PS颗粒。木兰醇（MAG）购自华为瑞科化学科技有限公司（中国北京），从木兰树皮中提取，纯度为80%（试剂商标说明）。
**细胞培养**
禽类巨噬细胞系HD11购自Procell生命科学技术有限公司。该细胞系通过短串联重复序列（STR）分析进行鉴定，以确认其身份并排除交叉污染。此外，在所有体外实验之前，这些细胞都经过常规筛查，确认没有支原体污染。HD11鸡巨噬细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基（Gibco, Carlsbad, CA, USA）中培养，培养条件为37°C和5% CO2的湿润培养箱。当细胞密度达到80-90%时进行传代。
**体外处理**
当细胞密度约为60%时，将HD11细胞接种并处理。细胞被分为三组：对照组（CK）、PS组（PS）和MAG+PS组。PS组接受200 μg/mL的PS处理12小时，以建立稳定的炎症激活模型；MAG+PS组同时接受50 μM的MAG和200 μM的PS处理12小时。选择50 μM的MAG浓度是基于之前的巨噬细胞相关抗炎研究和我们的初步观察结果，该浓度下未观察到明显的细胞毒性。这些浓度用于评估MAG是否可以直接调节PS引起的巨噬细胞炎症激活。在体外细胞实验中，木兰醇首先溶解在二甲基亚砜（DMSO）中制备储备溶液，然后稀释至目标工作浓度。培养基中的DMSO最终浓度严格控制在0.1%（v/v）以下，以避免溶剂引起的细胞毒性。对照组细胞接受等体积的DMSO溶剂（Miao et al., 2024）。
**实验设计与饮食**
浙江大学动物护理和使用委员会批准了本动物实验方案（编号ZJU20220310）。共270只37周龄的海兰白鸡从商业农场获取，并随机分为三组（表S1）：对照组（CK）、PS暴露组（PS）和木兰醇保护组（PM）。每组包含6个重复实验，每个重复实验有15只鸡（Zeng et al., 2026）。CK组和PS组的鸡喂食基础饲料，而PM组的鸡在整个12周实验期间喂食添加了400 mg/kg MAG的基础饲料。为了确保饲料的均匀性，采用逐步扩增法（几何稀释技术）将MAG加入饲料中。简而言之，首先将MAG粉末与少量玉米淀粉载体预混合，然后与预混料混合，最后使用垂直混合器彻底与基础饲料混合。最佳喂食剂量已通过我们的先前研究确定（Lv et al., 2024）。此外，修订后的补充材料中还包括一个单独的仅含MAG的喂食实验，以支持MAG膳食补充的安全性和剂量选择（补充图S2）。在该实验中，37周龄的海兰白鸡被分为CK组、MAG200组、MAG400组和MAG600组，每组15只鸡。这些鸡分别喂食添加了0、200或600 mg/kg MAG的基础饲料，持续12周。实验结束时，每组选取6只鸡进行肝脏形态学和血清生化分析。所配制的基礎饲料（表S2）符合或超过了美国国家研究委员会（NRC, 1994）推荐的营养要求。在最初的8周饮食处理后，PS组和PM组的鸡每天通过灌胃接受1 mg/mL的PS悬浮液，持续4周，而CK组则接受等体积的PBS。因此，在PM组的PS暴露期间持续补充MAG。PS的暴露剂量是根据之前关于微塑料对家禽动物毒性的研究选择的（Chen et al., 2023; Guo et al., 2024; Yin et al., 2023b）。笼子内的环境条件得到精确监控，确保鸡能够持续获得水和食物。
**样本收集与制备**
在12周试验结束时，每组选取体重接近平均值的6只鸡，通过颈椎脱位进行人道安乐死。收集输卵管组织，特别是卵黄囊和子宫；代表性部分用4%甲醛或2.5%戊二醛固定，其余部分快速冷冻以备后续分子分析（Wang et al., 2022）。
**鸡蛋内部和外部质量的测定**
在12周实验期间，每天记录每组的产蛋量和鸡蛋破损率。鸡蛋破损率（%）=（破损鸡蛋数量 / 总鸡蛋数量）× 100%。在12周试验结束时，根据之前的方法评估鸡蛋质量（Liu et al., 2021b）。为了评估鸡蛋质量，在24小时时间内收集每组36个新鲜产下的鸡蛋（每个重复实验6个鸡蛋）。使用数字游标卡尺测量计算鸡蛋形状指数所需的尺寸。使用鸡蛋质量检测仪（DET-6000；Nabel Co., Ltd., Kyoto, Japan）测定鸡蛋总重量、蛋壳强度、卵白高度、Haugh单位和蛋黄颜色。蛋壳厚度（不包括壳膜）在3个点（尖端、钝端和赤道）使用蛋壳厚度测量仪（ESTG-1，Orka Food Technology Ltd.，Ramat Hasharon，以色列）进行测量，并根据3个点的平均值估算每个蛋的厚度（Fu等人，2024年）。扫描电子显微镜（SEM）：输卵管和子宫段用冷却生理盐水冲洗，并浸入2.5%的戊二醛中固定（4°C）。经过分级乙醇脱水系列处理后，样品进行临界点干燥并镀金，然后在Hitachi S-4800场发射SEM下观察。对于壳的超微结构，检查了赤道片段；使用SEM的集成测量软件量化了形态参数，包括乳突厚度（MT）、有效厚度（ET：栅栏层、垂直晶体层和角质层）和乳突宽度（MW）（Cao等人，2019年；Chen等人，2025年）。透射电子显微镜（TEM）：将产蛋鸡输卵管子宫部分的组织切成小块（1毫米×1毫米×1毫米）。固定的子宫部分用分级乙醇系列脱水并切成超薄切片。然后使用醋酸铀和柠檬酸铅染色。随后使用透射电子显微镜（JEOL-JEM-1200EX，Peabody，马萨诸塞州，美国）获得显微照片，如前所述（Gou等人，2024年；Liu等人，2021a）。输卵管和子宫微生物群分析：根据规定的协议使用MagBeads FastDNA Kit for Soil（MP Biomedicals，美国）从样品中分离基因组DNA，然后在-20°C下冷冻保存。使用Pacific Biosciences（PacBio）Sequel平台进行单分子实时（SMRT）测序，由上海Personal Biotechnology Co., Ltd.执行。后续的数据处理和可视化通过Personalbio云基础设施完成（https://www.genescloud.cn/home）（Cao等人，2019年；Chen等人，2025年；Gong等人，2020年）。组织和形态学分析：将固定于福尔马林中的输卵管和子宫部分切成薄片，并用苏木精和伊红（H&E）以及阿尔辛蓝过碘酸酯-希夫（AB-PAS）染色进行形态测量分析，如前所述（Ge等人，2024年；Liu等人，2021年；Zhou等人，2021年）。TUNEL检测：首先将固定的石蜡切片脱蜡，依次放入二甲苯、无水乙醇和梯度酒精中，并用蒸馏水洗涤，以确保切片准备好进行后续处理。接下来，将蛋白酶K工作液滴加到切片上并在37°C下孵育20分钟，然后用PBS洗涤以去除多余液体。然后将切片在避光条件下孵育于3%过氧化氢溶液中，再次洗涤。然后，将切片在室温下与缓冲液平衡，并加入反应溶液的适当比例进行标记反应，随后用链霉亲和素-HRP反应溶液增强信号并显色。显色后，用苏木精染色细胞核，最后将切片脱水并密封，以确保其在光学显微镜下保存良好（Hu等人，2025年；Lin等人，2025年）。免疫荧光分析：将石蜡切片在水中脱蜡并进行抗原修复。应用荧光淬灭剂并封闭后，将切片在4°C下与以下一级抗体孵育过夜：抗Claudin（1:1000；Servicebio，武汉，GB152543-50）、抗MUC-2（1:1000；Servicebio，武汉，GB15344-100）、抗TNF-α（1:100；Servicebio，武汉，GB153968-100）、抗F4/80（1:500；Servicebio，武汉，GB113373-100）和抗NF-κB p65（1:1000；Servicebio，武汉，GB11997-100）（Lin等人，2025年）。随后，洗涤切片并与相应的二级抗体孵育。经过DAPI染色和第二次自动荧光淬灭后，将切片安装在抗荧光淬灭介质中。最后，使用荧光显微镜捕获图像（Lv等人，2024年）。RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）：按照制造商的说明，使用FreeZol Reagent（Vazyme，R711-01）从输卵管和子宫中提取RNA。使用HiScript III Kit（Vazyme，R312-01）将RNA逆转录为cDNA，其中包括gDNA去除步骤。随后使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）在Bio-Rad CFX Connect™平台上通过qRT-PCR定量转录本水平（Gong等人，2020年）。使用的特异性引物见表S3。目标基因表达使用2-ΔΔCt方法相对于β-actin mRNA进行标准化（Li等人，2018年）。氧化应激指标的测定：收集输卵管和子宫部分以测定氧化应激相关指标。简而言之，组织样品在冰冷的生理盐水中匀浆并离心以获得上清液。根据制造商的说明，使用商业检测试剂盒测量丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总抗氧化能力（T-AOC）的水平。检测试剂盒购自南京建城生物工程研究所（南京，中国），包括MDA检测试剂盒（A003-2）、T-SOD检测试剂盒（A001-1）、GSH-Px检测试剂盒（A005-1-1）和T-AOC检测试剂盒（A015-2-1）。使用商业蛋白质检测试剂盒确定组织匀浆中的蛋白质浓度，并将所有氧化应激指标标准化为蛋白质浓度。MDA水平表示为nmol/mg蛋白质，而T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性表示为U/mg蛋白质。统计分析：使用IBM SPSS Statistics 26.0中的单因素ANOVA模块进行统计评估（SPSS Inc.，芝加哥，IL），并通过Tukey的事后分析确定处理组间的差异。显著性预设为P < 0.05。所有实验数据以平均值±标准差（SD）表示。用于图表生成和图像处理的软件是GraphPad Prism 9.5（GraphPad Software Inc.，圣地亚哥，CA）（Li等人，2022年）。结果：经过8周的MAG预处理和随后的4周PS暴露后，产蛋性能如表S4所示，蛋的质量在图1中进行了检查。与CK组相比，PS暴露显著增加了破损蛋率并降低了白蛋白高度和Haugh单位（P < 0.05，图1A、F和H）。然而，MAG可以部分缓解对破损蛋率、白蛋白高度、Haugh单位和蛋壳强度的不利影响（P < 0.05，图1A、C、F和H）。各组之间的蛋重、蛋壳重量/蛋重（%）、蛋形指数和蛋黄重量百分比没有显著差异（P > 0.05，图1B、D、E和G）。蛋壳微结构的结果显示，与CK组相比，PS暴露显著降低了蛋壳的有效厚度和总厚度（P < 0.05）。PM组有趋势缓解PS暴露引起的蛋壳有效厚度和总厚度的减少，但差异不显著（P > 0.05）。然而，对蛋壳乳突宽度和乳突厚度没有观察到显著影响（图1I和J）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图1. MAG改善了暴露于PS的鸡的蛋质量和蛋壳超微结构。（A）饲料试验期间的破损蛋率；（B-H）实验结束时测量的蛋质量指标；（I）通过扫描电子显微镜测量的蛋壳超微结构，比例尺=50μm和200μm；（J）蛋壳超微结构的定量数据，包括总厚度、蛋壳有效厚度、乳突厚度和乳突层宽度。缩写：TT：蛋壳总厚度；ET：蛋壳有效厚度；MT：乳突层乳突厚度；MW：乳突层乳突宽度。数据以平均值±标准差（SD）表示。每组n=6只鸡。*P < 0.05，**P < 0.01。输卵管壶腹的形态学分析：图2A展示了输卵管壶腹的形态和分泌功能。H&E染色显示PS暴露导致炎症细胞浸润、腺上皮细胞坏死和脱落。然而，MAG补充剂缓解了PS暴露引起的不利影响（图2B）。AB-PAS染色结果显示，PS组表现出严重的杯状细胞功能障碍、杯状细胞成熟受损以及黏液层破坏。相反，在PM组中，杯状细胞消耗有所改善，黏液层相对保持完整（图2C）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. MAG缓解了PS暴露引起的输卵管壶腹损伤。（A）产蛋鸡输卵管形态的总体外观；（B）输卵管壶腹的H&E染色代表图像及部分放大图。蓝色箭头表示上皮细胞变性、坏死或脱落，比例尺=1.2mm和200μm；（C）输卵管壶腹的AB-PAS染色，比例尺=1.2mm和200μm。输卵管子宫的形态学分析：图3A展示了产蛋鸡输卵管子宫的形态。H&E染色分析显示，PS暴露显著减少了（P < 0.05）子宫黏膜皱褶的面积、绒毛长度和宽度。然而，MAG预处理缓解了子宫黏膜损伤，如子宫黏膜皱褶的面积和宽度显著增加所证实的（P < 0.05，图3B和E）。进一步研究了子宫的超微结构，如图3C所示。CK组的子宫结构完全完整，表面光滑，绒毛排列密集，而在PS组中，子宫绒毛显著减少且粗糙。然而，在PM组中，子宫绒毛的减少和粗糙度都得到了缓解。TEM结果显示，与CK组相比，PS暴露导致紧密连接蛋白表达减少。然而，MAG缓解了PS暴露引起的紧密连接蛋白表达下降（图3D）。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图3. MAG缓解了PS暴露引起的输卵管子宫损伤。（A）输卵管子宫的总体外观；（B）输卵管子宫的H&E染色代表图像及部分放大图。形态参数包括绒毛长度（L）、高度（H）、宽度（W）和黏膜皱褶的面积（S），比例尺=2.5mm和625μm；（C）输卵管子宫部分的SEM发现，局部放大图像，比例尺=30μm和10μm；（D）输卵管子宫部分的透射电子显微镜发现及局部放大图，比例尺=2μm；（E）上述形态参数的定量数据。数据以平均值±标准差表示。每组n=6只鸡。*P < 0.05，**P < 0.01。输卵管壶腹和子宫微生物群的分析：alpha多样性包括多样性（通过Shannon和Simpson指数评估）和丰富度（通过Chao1指数测量）。在本研究中，各组之间的alpha多样性没有显著差异（P > 0.05，图4A和E）。通过Bray-Curtis距离在ASV水平上使用主坐标分析（PCoA）分析beta多样性。PM组的样本聚集在一起，这与CON组和PS组不同，表明MAG喂养后输卵管微生物群结构有显著差异（图4B和F）。PS暴露和MAG处理改变了物种水平的输卵管微生物群相对丰度。如图4C和G所示，Lactobacillus crispatus是输卵管壶腹和子宫区域中最丰富的细菌。在PS暴露下，Lactobacillus crispatus的含量减少，而在MAG补充后，其在MAG组中的相对丰度显著增加。为了进一步表征与MAG处理和PS暴露相关的输卵管壶腹和子宫微生物群，进行了LEfSe分析以识别三个实验组之间有显著差异的属。输卵管壶腹分析（图4D）显示了12个分类生物标志物（LDA得分>2）。值得注意的是，s_Lactobacillus_crispatus在CK组中的丰度较高，而s_Sanguibacter_inulinus、s_Flavobacterium_sp._HDG3和s_Clostridium_perfringens也被鉴定为区分性生物标志物。子宫微生物群分析（图4H）识别了8个分类生物标志物。CK组显示s_Desulforamulus_aeronauticus、s_Paenibacillus_peoriae和s_Haemophilus_haemolyticus的水平升高。此外，s_Nocardioides_sp.和s_Streptomyces_sp._HB-3在其他组中被突出显示为生物标志物。下载：下载高分辨率图像（841KB）下载：下载全尺寸图像图4。MAG改善了由聚苯乙烯（PS）引起的输卵管和子宫微生物群紊乱。(A和E) 输卵管和子宫微生物群的Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数；(B和F) 在ASV水平上输卵管和子宫微生物群组成的主坐标分析（PCoA）图；(C和G) 输卵管和子宫微生物群在物种水平上的丰度百分比；(D和H) 从物种水平分析的LDA效应大小（LEfSe）（LDA得分2）。数据以平均值±标准差表示，每组n=6只鸡。
**输卵管和子宫屏障功能分析**
为了评估MAG对输卵管和子宫屏障功能的保护作用，通过免疫荧光测定和qRT-PCR测量了输卵管和子宫的紧密连接（TJ）蛋白（图5）。免疫荧光结果显示，与CK组相比，PS组的Claudin和MUC-2的平均荧光强度显著降低（P < 0.05）。然而，PM预防组显著改善了PS暴露引起的Claudin荧光强度的下降（图5A、C和D）。qRT-PCR结果显示，PS暴露显著降低了子宫中Occludin、MUC-2和Claudin-1的mRNA水平（P < 0.05），而在PM组中这些变化得到了逆转（图5E）。PAS染色用于观察不同处理对杯状细胞黏蛋白分泌的影响。结果表明，PS暴露导致黏蛋白分泌减少，而PM组有效逆转了PS暴露引起的下降（图5B）。
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**图5. MAG改善了暴露于PS的产蛋鸡的输卵管和子宫屏障功能。**
(A) 输卵管子宫部分Claudin蛋白表达的免疫荧光染色；放大图显示了部分典型结果的放大情况，比例尺=1mm和0.1mm；
(C) 输卵管子宫部分MUC-2蛋白表达的免疫荧光染色，比例尺=1mm和0.1mm；
(B) 输卵管子宫部分的PAS特殊染色结果；
(D) 上述两种免疫荧光染色的定量结果（Claudin和MUC-2）；
(E) 输卵管子宫部分与紧密连接相关的基因表达。数据以平均值±标准差表示。n=每组6只鸡。*P < 0.05, **P < 0.01。**
**输卵管和子宫细胞凋亡及氧化应激分析**
为了研究PS暴露和MAG处理对产蛋鸡输卵管和子宫细胞凋亡的影响，进行了免疫组化染色和qRT-PCR分析（图6）。结果显示，PS暴露后，输卵管和子宫部分的TUNEL阳性区域显著增加（P < 0.05），以及Bax（Bcl-2相关X）、Caspase3和Caspase8的相对mRNA表达水平也显著增加（图6A、B、C和E）。然而，与PS组相比，PM组的上述凋亡相关指标显著降低（P < 0.05）（图6D和F）。值得注意的是，在三个处理组的产蛋鸡输卵管中，Caspase 9的相对mRNA表达水平没有显著差异（P > 0.05）。
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**图6. MAG抑制了暴露于PS的产蛋鸡输卵管和子宫的细胞凋亡。**
(A) 输卵管子宫部分TUNEL染色的代表性图像。放大图显示了指定区域的放大视图；
(B) 输卵管子宫部分的TUNEL结果；
(C和E) IHC的定量结果；
(D) 输卵管子宫部分凋亡相关基因的mRNA水平；
(F) 子宫部分凋亡相关基因的mRNA水平。数据以平均值±标准差表示。n=每组6只鸡。*P < 0.05, **P < 0.01。**
**进一步确定氧化应激是否导致PS引起的输卵管损伤**
为了进一步确定氧化应激是否参与了PS引起的输卵管损伤，测量了输卵管和子宫部分的氧化应激相关指标（图7）。在输卵管中，PS暴露显著增加了MDA水平，并降低了T-SOD、GSH-Px和T-AOC的活性，而MAG补充显著降低了MDA水平并恢复了T-SOD和GSH-Px的活性，T-AOC也显示出恢复趋势。在子宫部分，PS暴露显著增加了MDA水平，并降低了T-SOD、GSH-Px和T-AOC的活性，这些变化通过MAG补充得到了显著逆转。这些结果表明，PS暴露在输卵管中引起了氧化应激，而膳食MAG补充改善了抗氧化状态，尤其是在输卵管子宫部分。
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**图7. MAG减轻了暴露于PS的产蛋鸡输卵管中的氧化应激。**
(A) 输卵管子宫部分氧化应激相关指标，包括MDA、T-SOD、GSH-Px和T-AOC；
(B) 输卵管子宫部分氧化应激相关指标，包括MDA、T-SOD、GSH-Px和T-AOC。数据以平均值±标准差表示。n=每组6只鸡。*P < 0.05, **P < 0.01。**
**输卵管和子宫炎症反应分析**
为了进一步研究PS暴露引起的输卵管损伤是否由炎症因子和巨噬细胞极化引起，我们分别检测了扩大的输卵管和子宫切片中巨噬细胞标记物的荧光标记以及炎症相关基因的表达。免疫荧光染色显示，与对照组相比，PS组中F4/80和TNF-α的平均荧光强度显著增加（P < 0.05）。相反，PM组中F4/80和TNF-α的平均荧光强度显著降低（P < 0.05）（图8A、B、D和9A、B、D）。为了进一步研究PS暴露对输卵管和子宫炎症反应的影响，通过qRT-PCR检测了TNF-α、IL-1β、IL-10和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的相对表达水平。结果显示，PS暴露显著上调了炎症细胞因子TNF-α和IL-1β（P < 0.05），但降低了IL-10的相对表达水平（图8E）。重要的是，PS和MAG联合处理有效抑制了这种上调（P < 0.05）。值得注意的是，三个处理组之间IL-1β和iNOS的表达没有显著差异（P > 0.05）（图9E）。为了确定输卵管子宫部分鸡蛋质量变化与炎症反应之间的潜在联系，相关性分析（图8C）显示，输卵管中的炎症细胞因子升高与蛋白质量指标（Haugh单位和蛋白高度）呈负相关。这表明输卵管中的局部炎症直接影响了蛋白分泌。在子宫中也观察到了类似的模式（图9），其中促炎标志物与蛋壳质量特征呈强负相关。图8和图9之间的这种一致性证实了PS引起的炎症是不同输卵管段功能损伤的持续驱动因素。
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**图8. MAG抑制了暴露于PS的产蛋鸡输卵管子宫的炎症反应。**
(A) 输卵管子宫部分巨噬细胞标记物F4/80的免疫荧光结果，放大图显示了部分典型结果的放大情况，比例尺=0.1mm和20μm；
(B) 输卵管子宫部分炎症因子TNF-α的免疫荧光结果，比例尺=0.1mm和20μm；
(C) 表征输卵管子宫功能的鸡蛋质量指标与其炎症因素的相关性分析；
(D) 上述两种免疫荧光染色的定量结果（F4/80和TNF-α）；
(E) 与炎症反应相关的基因的相对mRNA表达。数据以平均值±标准差表示。n=每组6只鸡。*P < 0.05, **P < 0.01。**
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**图9. MAG抑制了暴露于PS的产蛋鸡输卵管子宫的炎症反应。**
(A) 输卵管子宫部分巨噬细胞标记物F4/80的免疫荧光结果，放大图显示了部分典型结果的放大情况，比例尺=1mm和0.1mm；
(B) 输卵管子宫部分炎症因子TNF-α的免疫荧光结果，比例尺=1mm和0.1mm；
(C) 表征输卵管子宫部分功能的鸡蛋质量指标与其炎症因素的相关性分析；
(D) 上述两种免疫荧光染色的定量结果（F4/80和TNF-α）；
(E) 与子宫炎症反应相关的基因的相对mRNA表达。数据以平均值±标准差表示。n=每组6只鸡。*P < 0.05, **P < 0.01。**
**HD11细胞炎症反应分析**
结果显示，与CK组相比，PS处理显著增强了NF-κB和TNF-α的平均荧光强度（图10）。此外，与PS组相比，PM组中TNF-α的平均荧光强度显著降低（图10A、B和C）。IL-12、IL-1β、TNF-α、CD86（T淋巴细胞活化抗原）和IL-6的mRNA表达被认为是M1激活的标志，而IL-10、CD163（清道夫受体）、TGF-β和甘露糖受体（CD206）的表达被认为是M2激活的标志。结果显示，与CK组相比，PS处理显著增强了IL-12、IL-1β、TNF-α、CD86和IL-6的表达水平（P < 0.05）；同时显著降低了IL-10、CD163、TGF-β和CD206的表达水平（P < 0.05）。然而，与PS组相比，PM组中这些指标表现出相反的趋势（图10D和E）。
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**图10. MAG调节了HD11巨噬细胞的极化趋势。**
(A) HDII细胞中NF-κB的免疫荧光结果，比例尺=20μm；
(B) HDII细胞中TNF-α的免疫荧光结果，比例尺=20μm；
(C) 上述两种免疫荧光染色（NF-κB和TNF-α）的定量结果；
(D) M1极化相关标记基因的mRNA表达；
(D) M2极化相关标记基因的mRNA表达。数据以平均值±标准差表示。n=每组3个样本。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。**
**讨论**
由于塑料在农业和畜牧业生产中的广泛应用，包括饲料包装和塑料水管（Ijaz等人，2024年），微塑料污染严重威胁着动物的健康。根据化学组成，微塑料可以分为不同类型的聚合物（Allouzi等人，2021年），研究表明PS是胎盘酶中毒性最大的聚合物之一（Zhong等人，2021年）。现有证据表明，PS对家禽的肝脏和结肠具有毒性作用，并伴有肠道微生物群的紊乱（Yin等人，2023b）。然而，其对产蛋鸡生殖系统，特别是输卵管的影响尚不清楚。本研究的结果表明，PS引起的生殖毒性会导致输卵管微生物群紊乱和炎症浸润，从而损害子宫黏膜屏障并降低鸡蛋质量。此外，MAG（木兰提取物）通过有效调节微生物组成增加了有益细菌的数量，恢复了黏膜屏障损伤，并通过抑制M1巨噬细胞的极化和防止PS引起的炎症浸润来改善鸡蛋质量。它还对PS引起的生理毒性具有保护作用，表明MAG在PS相关预防策略中具有潜在的应用价值。
已经确定PS对生长性能有负面影响。暴露于PS影响了日本鹌鹑的生长速率（Monclús等人，2022年）。微塑料暴露影响了无壳鹌鹑孵化时的湿重和体长（Li等人，2021年）。与这些结果一致，PS暴露影响了产蛋性能和鸡蛋质量，主要表现为鸡蛋破损率的增加和鸡蛋质量的下降。输卵管是一种长管状结构，由五个不同的功能部分组成：用于受精的漏斗部、用于产生卵白的膨大部分、用于形成软壳膜的峡部、用于形成钙化卵壳的壳腺或子宫部以及用于产卵的阴道部。膨大部分是输卵管中最长的部分，在鸡蛋通过该区域的过程中（持续约3小时）为鸡蛋提供卵白蛋白（Sah和Mishra，2019）。卵白的质量通常通过卵白高度和HU值来衡量，这是评估鸡蛋内部质量的标准指标。HU值是通过结合卵白的高度和鸡蛋的重量计算得出的（Wang等人，2018）。研究结果显示，当鸡蛋受到聚苯乙烯（PS）污染时，其卵白高度和HU值均显著下降，而通过在饮食中添加MAG可以有效缓解这一趋势。随着年龄和母鸡的生长，子宫内膜的形态会发生变化，导致卵壳异常，从而降低卵壳的质量（Park和Sohn，2018）。卵壳质量是生产高质量鸡蛋的关键因素，对商业鸡蛋产业有重要影响（Xiao等人，2014）。卵壳的超微结构包括乳头状层、栅栏层和垂直晶体层。任何卵壳结构的缺陷都会导致卵壳质量下降。扫描电子显微镜（SEM）的结果显示，PS污染会导致卵壳厚度减少，与对照组相比有效厚度显著降低。值得注意的是，虽然我们的研究重点关注了直接反映输卵管分泌功能的物理指标（如Haugh单位和卵壳强度），但当前研究并未评估PS暴露对鸡蛋感官风味和详细营养成分（如氨基酸组成或微量营养素沉积）的潜在影响。鉴于微塑料可能通过干扰代谢过程来影响风味化合物的积累，未来的研究需要探讨这些多维度因素对鸡蛋质量的影响，从而更全面地评估环境污染物带来的食品安全风险。
家禽生殖道的微生物群组成与肠道相似，这是由于鸡的生理特性（Shterzer等人，2020）。生殖道微生物群对产蛋鸡的健康和生产力起着关键作用（Su等人，2021a）。一项研究分析了具有不同卵质量和数量表型的产蛋鸡生殖道各部分的微生物组成，发现不同输卵管段的微生物群存在差异（Wen等人，2021）。研究表明，PS暴露后膨大部分和子宫部分的微生物群组成和多样性受到负面影响；然而，添加MAG可以减轻这些不良影响。据报道，Lactobacillus crispatus通过产生乳酸、维持低pH值和抗炎免疫调节作用来维护黏膜屏障健康（Alizhan等人，2025；Decout等人，2024）。结果显示，PS暴露下Lactobacillus crispatus的相对丰度降低，而添加MAG后显著增加。此外，决定阴道微生物群先天免疫反应的机制尚不清楚，但免疫细胞和上皮细胞中先天免疫受体介导的转录因子NF-κB的激活是一个核心特征（Doerflinger等人，2014）。因此，我们将NF-κB视为微塑料诱导炎症的核心调节因子。
卵壳主要在母鸡的子宫部（或卵壳腺）形成，这是整个卵形成过程中最长的阶段（Cheng和Ning，2023）。已在产蛋鸡的输卵管子宫部鉴定出几种与化学屏障相关的关键成分，包括禽β-防御素和MUC-2（Elhamouly等人，2019；Yoshimura，2015）。此外，Claudins可以通过形成细胞间物理屏障来保护组织免受有毒物质和病原体的侵害，在产蛋鸡的输卵管黏膜中，Claudin-1和Claudin-3的表达水平可作为机械屏障功能的指标（Ariyadi等人，2013）。AB-PAS染色结果显示，PS暴露组黏蛋白分泌减少，免疫荧光MUC-2标记信号减弱，这与分泌细胞标记基因（MUC-2）的表达下降一致；而SEM结果显示，PS暴露后子宫部分的微绒毛损伤程度增加，透射电子显微镜（TEM）结果显示紧密连接间隙变宽，微绒毛脱落增多，免疫荧光Claudin标记信号减弱，这与紧密连接相关mRNA（Claudin-1、Occludin和ZO-1）的表达下降一致。此外，当饮食中添加MAG时，PS污染对输卵管黏膜屏障的负面影响得到有效缓解，这与Fan等人的先前研究结果一致，他们发现给患有结肠炎的小鼠喂食MAG后，肠道炎症浸润和屏障损伤得到了有效恢复（Fan等人，2023）。
越来越多的证据表明，PS会在多个器官中激活炎症反应，包括肝脏、外周免疫系统和结肠（Huang等人，2022）。此外，炎症越来越被认为是导致生殖功能障碍的一个因素（Negishi等人，2020）。现有研究表明，长期暴露于PS会导致子宫炎症，表现为炎症细胞因子的异常表达（Qin等人，2024）。对输卵管膨大部分和子宫部的HE结果显示，PS暴露后出现炎症浸润，而添加MAG后炎症浸润减轻。TNF-α是一种促炎细胞因子，在介导细胞凋亡、炎症和免疫过程中起关键作用。相应地，输卵管和子宫部的TNF-α免疫荧光标记信号增强，巨噬细胞标记物F4/80的分析显示，PS暴露组的信号强度高于对照组。这与输卵管中促炎相关因子（TNF-α、IL-6）的基因表达上调以及抗炎因子IL-10的mRNA水平下调一致，表明产蛋鸡的输卵管受到PS污染的损害，观察到显著的炎症效应。研究表明，PS处理组中炎症因子TNF-α和IL-6的释放可能是通过激活NF-κB途径促成的。NF-κB途径的激活会导致炎症，抑制凋亡途径中的Bcl-2（B细胞淋巴瘤-2）表达，并增加Bax的表达，从而导致细胞凋亡（Cao等人，2023）。TUNEL结果和凋亡相关基因的表达也支持这一点，表明PS处理后细胞凋亡显著增加。然而，当饮食中添加MAG时，这种现象得到缓解，证实MAG可以通过抗炎途径抑制细胞凋亡。氧化应激被认为是PS诱导组织损伤的重要上游事件。过度的氧化应激会促进脂质过氧化，损害上皮屏障完整性，并放大炎症信号，从而导致细胞凋亡和组织功能障碍。本研究发现，PS暴露增加了卵管中的MDA水平，并降低了T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性，表明PS暴露在膨大部分和子宫部分引起了氧化损伤。值得注意的是，饮食中添加MAG减少了MDA的积累，并恢复了抗氧化酶活性，尤其是在卵管的子宫部分。这些发现表明，MAG对PS诱导的输卵管损伤的保护作用不仅与免疫调节有关，还与改善氧化应激状态有关。
不同类型的免疫细胞会受到PS的影响。较小的颗粒，尤其是纳米级的颗粒，可以被动穿过细胞膜（Xiang等人，2026）。淋巴细胞（Sarma等人，2022）、中性粒细胞（Chi等人，2022）和巨噬细胞（Tang等人，2022）可以吞噬纳米级塑料颗粒。尽管小鼠巨噬细胞可以吞噬直径为10μm的PS颗粒，导致代谢转向糖酵解并降低线粒体呼吸（Merkley等人，2021）。Zhao等人报告称，Lactobacillus plantarum通过触发TLR2/NF-κB途径诱导M1极化，抑制沙门氏菌引起的输卵管炎症和萎缩（Zhao等人，2022）。巨噬细胞极化是指巨噬细胞根据微环境信号采取不同功能状态的过程。当受到外源性物质刺激时，巨噬细胞可能被激活并极化为两种不同的表型：促炎的M1（经典激活的巨噬细胞）和抗炎的M2（交替激活的巨噬细胞）（Murray等人，2014）。研究表明，M1巨噬细胞可以分泌促炎细胞因子TNF-α和IL-6，PS刺激RAW264.7细胞后也会分泌这些细胞因子，表明PS会诱导巨噬细胞极化为M1表型（Wang等人，2023），这与先前的体内研究一致，显示PS会增加组织中M1的比例。因此，PS可能通过诱导巨噬细胞极化为M1并释放炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-10）来引发炎症反应。
巨噬细胞极化受到细胞内信号网络的严格调控，其中NF-κB途径在驱动M1表型中起关键作用。先前的研究表明，NF-κB p65的激活和核转位会启动关键M1相关基因的转录，包括TNF-α、IL-1β和iNOS（Chunlian等人，2014）。我们的体外实验结果表明，PS暴露引发了显著的NF-κB激活，同时伴随着向M1样炎症极化的转变。值得注意的是，MAG处理有效抑制了NF-κB信号，这有助于解释观察到的M1标记物减少和M1/M2平衡的部分恢复（Li等人，2010）。尽管体外HD11细胞模型提供了MAG直接抑制PS诱导的NF-κB激活和M1样炎症极化的证据，但体外使用的浓度可能无法完全再现输卵管中的局部暴露水平。未来需要使用更广泛的剂量-反应设计和生理相关暴露模型进行研究。值得注意的是，PS诱导的炎症损伤可能是由多途径网络共同介导的，而不仅仅是NF-κB单独作用的结果。先前的研究表明，PS暴露可能激活TLR2/NF-κB信号、ROS/NLRP3炎性小体激活和MAPK途径。在本研究中，我们关注NF-κB是因为其在巨噬细胞炎症激活和M1样极化中的核心作用。因此，我们的发现表明，MAG至少部分通过抑制NF-κB介导的巨噬细胞激活来缓解PS诱导的输卵管炎症。ROS/NLRP3和MAPK途径是否也参与这一过程需要进一步研究。
此外，PS暴露导致Lactobacillus crispatus的减少与输卵管中的M1巨噬细胞极化同时发生。新兴证据表明，微生物群与巨噬细胞之间存在重要的相互作用，其中Lactobacillus spp.及其代谢物可以抑制NF-κB信号并促进抗炎M2表型（Zhang等人，2023）。因此，我们认为观察到的M1极化不仅是由PS的毒性引起的，还与L. crispatus介导的免疫调节丧失有关。生物学上，PS暴露后Clostridium perfringens（一种已知的机会性家禽病原体）的富集强烈表明黏膜屏障受损，从而加剧了局部输卵管炎症。相反，MAG调节了具有抗菌肽生产潜力的Paenibacillus的丰度，进一步突显了MAG在恢复黏膜微生态平衡方面的有效性。MAG补充可能通过重塑微生物群和直接抑制NF-κB激活来恢复这种免疫平衡。尽管当前研究中直接共培养的证据有限，但这些发现强调了微生物群-免疫轴作为潜在的治疗靶点，值得进一步研究。
基于我们的体内和体外发现，我们提出了MAG的全面作用机制。MAG作为一种强效的NF-κB抑制剂，通过阻断p65亚单位的磷酸化和核转位，抑制下游促炎介质（TNF-α、IL-1β）的转录，从而抑制M1巨噬细胞的极化。此外，这种免疫调节作用创造了有利于有益Lactobacillus crispatus恢复的有利微环境，增强了黏膜屏障。这些发现共同表明，NF-κB介导的炎症激活、氧化应激状态和输卵管微生物群组成的联合调节可能是MAG缓解多氯联苯（PS）诱导的生殖毒性的重要机制。结论：多氯联苯暴露通过破坏输卵管微生物群、减少脆乳杆菌的数量、引发氧化应激以及诱发炎症和细胞凋亡，损害了产蛋鸡的生殖健康。这些变化削弱了黏膜屏障功能，导致蛋白和蛋壳质量下降。MAG的补充通过改善抗氧化状态、增加脆乳杆菌的数量以及抑制NF-κB介导的巨噬细胞炎症激活来对抗这些效应。MAG的免疫调节作用还得到了体外实验的支持。总体而言，MAG通过调节氧化应激、局部炎症、细胞凋亡和微生物群组成，恢复了输卵管黏膜的稳态，从而改善了蛋白分泌和蛋壳形成（图11）。我们的研究结果阐明了多氯联苯诱导的生殖损伤的重要病理特征，并提出了MAG介导的黏膜保护作为对抗塑料颗粒相关生殖毒性的潜在饮食策略。
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图11. MAG对多氯联苯暴露产蛋鸡输卵管损伤的缓解作用和机制的调控网络示意图
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吕玉洁：研究、方法学、数据管理、撰写——初稿
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所有贡献作者均仔细审阅了最终版本的文本，并正式认可其内容和结论。
数据和材料的可用性：
本研究中使用或分析的数据集可向相应作者提出合理请求后获取。
未引用的参考文献：
Auneer Ahmad等人，2023年
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