HIF脯氨酰羟化酶抑制剂（HIF-PHI）被用于治疗慢性肾脏病（CKD）相关贫血。这些药物可稳定缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α，进而激活红细胞生成和铁代谢通路。目前已获临床批准的HIF-PHI，包括罗沙司他（roxadustat）和莫利司他（molidustat），具有不同的分子结构和选择性谱，但其不依赖于HIF的作用仍知之甚少。本研究表明，罗沙司他和莫利司他可调节HIF缺失（HIF-null）细胞的线粒体功能、氧化应激、溶酶体活性和脂质积累，从而产生不同的细胞表型。值得注意的是，罗沙司他在HIF缺失细胞中表现出抗增殖和抗血管生成活性，这与通过稳定HIF驱动血管内皮生长因子（VEGF）介导的血管生成的预期相悖。RNA测序和通路分析揭示了化合物特异性的脱靶基因调控，这些调控影响了超出典型缺氧反应的细胞过程，包括能量代谢和免疫信号传导。这些发现揭示了潜在不良效应（如血栓形成）的潜在机制，并识别了替代的治疗通路，为优化HIF-PHI的安全性谱和扩展其在肿瘤学及代谢疾病中的临床应用提供了框架。
一、 研究背景与目的
慢性肾脏病（CKD）患者常并发贫血，主要因促红细胞生成素（EPO）产生减少和铁代谢受损。传统的促红细胞生成刺激剂（ESAs）治疗存在局限性。缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂（HIF-PHI）作为一种新型治疗药物，通过模拟缺氧稳定HIF-α，上调内源性EPO和铁代谢相关蛋白，为贫血治疗提供了新选择。目前已有五种HIF-PHI（罗沙司他、莫利司他、达普司他、瓦达司他、依那罗司他）在多个国家和地区获批用于CKD贫血。其中，罗沙司他和莫利司他具有截然不同的分子结构和PHD（脯氨酰羟化酶）亚型选择性。罗沙司他为2-酮戊二酸（2-OG）模拟物，缺乏选择性，可抑制所有三种PHD亚型（PHD1/EGLN2, PHD2/EGLN1, PHD3/EGLN3）及胶原脯氨酰-4-羟化酶（CP4H）等其他2-OG依赖性双加氧酶（2-OGDD）。莫利司他则结构紧凑，选择性高，主要靶向PHD2。尽管临床有效，但HIF-PHI的非HIF依赖性效应，即不依赖于稳定HIF-1α/HIF-2α的生物学作用，仍未被系统研究。这些潜在的脱靶效应可能解释部分临床观察到的不良事件（如血栓形成），也可能蕴藏着超越贫血治疗的新临床应用价值。因此，本研究旨在利用HIF-1α/HIF-2α双敲除细胞模型，系统阐明罗沙司他和莫利司他的HIF非依赖性生物效应及其分子机制。
二、 主要技术方法概要
研究核心采用了CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）技术，构建了PC-3人前列腺癌细胞的HIF-1α/HIF-2α双敲除细胞株（ΔHIF1ΔEPAS1）。通过蛋白质印迹、细胞增殖（MTT、BrdU掺入、活细胞成像）、集落形成、细胞周期/凋亡（流式细胞术）、高内涵成像（线粒体膜电位、活性氧、溶酶体、脂滴）、划痕愈合、血管生成（体外3D HUVEC微血管模型）以及裸鼠体内异种移植瘤模型等一系列功能学实验，系统评估了两种药物在HIF缺失背景下的效应。为阐明分子机制，对药物处理的ΔHIF1ΔEPAS1细胞和对照细胞进行了RNA测序（RNA-seq），并利用生物信息学工具（如Metascape）进行差异表达基因和通路富集分析，以揭示HIF非依赖性的转录重编程。
三、 研究结果
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罗沙司他和莫利司他影响HIF-1α、HIF-2α及其靶基因：成功构建的ΔHIF1ΔEPAS1细胞在缺氧或药物处理下均不表达HIF-1α/HIF-2α及其经典靶基因（如CAIX、BNIP3），证实其为功能性双敲除模型。
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罗沙司他和莫利司他影响细胞增殖和集落形成：罗沙司他显著抑制ΔHIF1ΔEPAS1细胞的增殖，而莫利司他对对照细胞的抑制作用更明显。两种药物均降低了对照细胞的集落体积和面积，但对ΔHIF1ΔEPAS1细胞的集落体积和面积无影响。在PHD1/2/3三敲除（ΔPHD1,2,3）细胞中，两种药物同样表现出抗增殖效应，提示其作用机制不依赖于PHD1-3，可能存在PHD非依赖性的脱靶机制。
- 3.
罗沙司他和莫利司他影响细胞周期和凋亡：两种药物均能降低BrdU掺入，并特异性影响细胞周期的S期和G1/0期分布，这些效应在对照和ΔHIF1ΔEPAS1细胞中均存在，表明是HIF非依赖性的。莫利司他显著降低了两种细胞的凋亡率，罗沙司他也呈现出降低凋亡的趋势。
- 4.
罗沙司他和莫利司他引起线粒体功能、氧化应激、溶酶体活性和脂质积累的变化：在ΔHIF1ΔEPAS1细胞中，两种药物均能提高基础较低的线粒体膜电位，并降低升高的活性氧（ROS）水平，显示出HIF非依赖性的抗氧化效应。罗沙司他可恢复ΔHIF1ΔEPAS1细胞在缺氧下降低的溶酶体活性，而莫利司他可提高对照细胞的溶酶体活性。罗沙司他（而非莫利司他）处理可导致ΔHIF1ΔEPAS1细胞脂质积累增加。这些结果表明两种药物能以HIF非依赖性的方式调节细胞代谢和细胞器功能，且效应具有化合物特异性。
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HIF-PHI抑制剂调节伤口愈合、血管生成和肿瘤形成：莫利司他显著抑制对照和ΔHIF1ΔEPAS1细胞的伤口愈合能力，罗沙司他则主要抑制ΔHIF1ΔEPAS1细胞。在HUVEC血管生成模型中，罗沙司他呈剂量依赖性地抑制VEGF刺激的血管出芽和网络形成。在裸鼠异种移植瘤模型中，罗沙司他治疗显著抑制了由对照细胞和ΔHIF1ΔEPAS1细胞形成的肿瘤生长，证实了其体内抗肿瘤效应是HIF非依赖性的。药物有效性通过显著提高小鼠血细胞比容得到验证。
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转录组学分析揭示了罗沙司他治疗独立于HIF-1α和HIF-2α的差异基因表达谱：RNA-seq分析显示，罗沙司他和莫利司他在ΔHIF1ΔEPAS1细胞中诱导了独特的、HIF非依赖性的转录重编程。通过过滤掉缺氧和HIF依赖的基因，研究聚焦于药物特异性的HIF非依赖性调控基因。通路分析显示，罗沙司他主要上调与核糖体生物合成、翻译调控和线粒体组织相关的通路，下调与细胞外基质（ECM）组织、细胞连接和血管内皮生长因子A-血管内皮生长因子受体2（VEGFA-VEGFR2）信号相关的通路。莫利司他则上调与肌肉收缩、胶原生物合成、DNA修复和细胞因子信号相关的通路，下调与细胞迁移、炎症反应、ECM组织和胆固醇代谢相关的通路。
四、 讨论与结论总结
本研究首次系统性地证实了临床批准的HIF-PHIs（罗沙司他和莫利司他）在HIF-1α/HIF-2α双敲除细胞中，仍能通过HIF非依赖性通路调控细胞增殖、周期、凋亡、线粒体功能、ROS稳态、脂代谢、血管生成和肿瘤生长。罗沙司他因其2-OG模拟的延伸结构，可能通过广泛抑制2-OGDD酶家族产生脱靶效应（如影响脂代谢）；而结构紧凑、选择性高的莫利司他则可能通过调控PHD的非HIF底物或其他信号级联产生多效性。研究揭示了两种药物潜在的非HIF依赖性抗血管生成效应，这可能与临床上观察到的血栓形成风险相关。同时，发现的HIF非依赖性抗增殖和代谢重编程效应，为这些药物在肿瘤和代谢性疾病领域的重新用途提供了理论基础。总之，这些发现不仅阐明了HIF-PHIs潜在不良反应的机制，也为优化其安全性和拓展临床应用框架提供了重要见解。
研究结论翻译：本研究表明，临床批准的HIF-PHIs罗沙司他和莫利司他可独立于HIF-1α/HIF-2α稳定化，通过HIF非依赖性途径调节细胞增殖、细胞周期进程、凋亡、线粒体功能、ROS稳态、脂质代谢、血管生成和肿瘤生长。这些发现阐明了潜在药物不良反应（如血栓形成）的机制，并为优化HIF-PHIs的风险-获益特征及确定其在肿瘤学和代谢疾病中的新治疗机会提供了框架。
