利用赖氨酸反应性共价结合剂靶向Pleckstrin同源结构域

蛋白质激酶等信号蛋白的抑制通常通过靶向其活性位点实现，例如激酶中的ATP结合位点。由于这些位点在进化上高度保守以维持对天然辅因子ATP的结合，开发特异性抑制剂具有挑战性。一种替代策略是鉴定蛋白质中其他具有功能重要性的位点，以获得更好的选择性。此类位点可能包括蛋白质-蛋白质相互作用位点或其他辅因子的结合位点。在BCR:ABL抑制方面，激酶叶中的肉豆蔻酰结合位点已被成功用于开发慢性髓性白血病的治疗药物。研究人员近期展示了靶向Aurora A激酶上TPX2结合位点可通过新机制实现高度特异性抑制。许多真核信号蛋白由多个独立结构域组成，这些结构域调节蛋白质的活性和定位。其中，Pleckstrin同源（PH）结构域是最常见的结构域之一，人类蛋白质组中估计约有250个。PH结构域通常通过与质膜内叶上的磷脂酰肌醇结合参与膜关联。以Akt为例，其N端PH结构域可与激酶结构域相互作用使其失活，但在脂质结合后可释放这种激活抑制。该机制的重要性已通过鉴定锁定PH结构域和激酶结构域于非活性状态的Akt抑制剂得到证实。Tec家族酪氨酸激酶是另一类含有PH结构域的信号蛋白，其膜关联对活性至关重要。作为更大Src超家族的成员，它们共享SH2-SH3-激酶结构域的核心结构，但在N端额外含有PH结构域和Zn²⁺结合Tec同源结构域（也称为BTK基序）。然而，与其他通常在N端肉豆蔻酰化因而内在膜结合的Src样激酶不同，Tec激酶的膜关联由PH结构域通过与质膜上磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP₃）的相互作用介导，PIP₃是PI3激酶活性的产物。

Bruton酪氨酸激酶（BTK）是研究最充分的Tec家族激酶之一。BTK在B细胞成熟中起关键作用，其突变失活导致X连锁无丙种球蛋白血症（XLA），在该疾病中（通常）男性个体缺乏B细胞和抗体介导的体液免疫保护。BTK也在癌症研究中被关注，主要表达于造血细胞，异常BTK干扰健康BCR信号，导致慢性淋巴细胞白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）及其他血液癌症中B细胞无控制的存活和增殖。有趣的是，BTK的异构体（p65BTK）也被认为驱动实体瘤（如结肠、乳腺和前列腺）的肿瘤进展，通过促进化疗耐药、促进肿瘤-基质通讯以及操纵巨噬细胞活性和免疫抑制。BTK的激活依赖于PH结构域与PIP₃的结合。膜招募介导的二聚化被认为可使BTK从其抑制形式释放，导致反式自磷酸化和BTK激活。鉴于大量突变发现于肌醇磷酸结合位点，且废除脂质结合可导致XLA，小分子抑制膜关联是BTK抑制的有效途径。例如，R28是参与PIP₃结合的关键残基之一，在多种XLA病例中发生突变，且同一残基突变为半胱氨酸（R28C）在小鼠中导致X连锁免疫缺陷。

靶向PH结构域预计并非易事，因为磷酸化磷脂酰肌醇的结合位点高度带电，且它们与PH结构域的相互作用主要为离子相互作用。此外，结合发生在结构域表面的相对浅口袋中，提供有限的三维空间。21世纪初，嘌呤类似物曲西立滨（triciribine）被发现其单磷酸活性形式可阻止Akt的膜招募后，被重新定位用途。正如高度带电口袋抑制剂所预期的那样，曲西立滨生物利用度有限，遗憾的是由于毒性和疗效不佳已从临床试验中撤回。已开发出针对Akt PH结构域E17K突变体的更好模拟PIP₃₃结合位点中心发现反应性赖氨酸残基，并将其作为开发阻断PIP₃与PH结构域结合的抑制剂的锚定点。

BTK作为Tec家族酪氨酸激酶成员，在B细胞发育和多种血液恶性肿瘤中扮演关键角色。当前FDA批准的BTK抑制剂均靶向高度保守的ATP结合位点，这限制了治疗指数，因为该位点在整个激酶组中保守性极高。研究人员探索了一种新颖的BTK抑制策略：靶向其PH结构域介导的膜招募和激活过程。该研究发表于《Journal of Medicinal Chemistry》，为PH结构域靶向抑制提供了重要的概念验证。

研究人员采用基于片段的药物发现策略，通过差示扫描荧光法（DSF）对720个片段化合物库进行筛选，鉴定出能够稳定野生型BTK PH结构域但对R28C突变体无稳定作用的片段。R28C突变体作为对照，因为R28是IP₄结合的关键残基。片段化合物1在晶体结构中意外地与K12形成可逆亚胺共价键，这是非设计性的共价修饰。随后通过X射线晶体学和等温滴定量热法（ITC）验证，证实该片段通过共价修饰K12并抑制亲脂分子IP₄与其竞争结合。混合溶剂分子动力学（MxMD）模拟评估了结合口袋的可成药性，指导片段增长方向。

为提升片段化合物1的结合效力，研究人员进行了多轮结构-结合关系（SBR）研究。第一轮在呋喃片段上引入苯环得到化合物2，晶体显示β1-β2环向外移动为苯环腾出空间。第二轮探索苯环邻位取代，发现卤素（溴、氯）可深入疏水口袋并与R13主链羰基形成水介导的卤键。第三轮进行2,6-双取代探索，发现较大的卤素原子优先占据疏水口袋。第四轮探索其他氯代和甲氧基取代模式，发现对位氯代化合物24可推动E108约1 Å以容纳卤素。第五轮进行骨架跃迁，以噻吩替代苯环，得到生物电子等排体29。最终通过24个配体结合的晶体结构，获得最佳化合物24。

结构-结合关系研究揭示，邻位和对位卤素取代苯环最有利于结合。化合物24表现出最高的总标记相对强度（96%）和最小的非特异性结合（多重标记相对强度仅4%）。DSF结果显示从初始片段1到先导化合物24，结合亲和力提升超过2个数量级。质谱研究证实标记的可逆性：无论添加顺序如何，系统最终达到相同平衡分布，表明为可逆亚胺形成。反应动力学具有pH依赖性，碱性环境有利反应，在pH 7.4时1小时内标记即可完成90%以上。通过计算预测BTK PH结构域中K12的pK_a值显著低于其他14个赖氨酸（7.05±1.29和8.82±0.80，而平均值为10.50±0.97和10.77±0.90），解释了其高反应性。

研究人员还分析了其他PH结构域（Akt、Grb1、DAPP1和pRex1），发现与K12等效的赖氨酸在其他结构中pK_a值同样较其他赖氨酸低2.2-3.2个单位，提示该共价策略可能具有更广泛的PH结构域抑制普适性。关于赖氨酸定向共价化学在细胞环境中的选择性担忧，研究人员指出可逆亚胺比不可逆亲电试剂风险更低，因其形成缓慢且需要预组织。同时需要非共价识别（特别是保守的精氨酸-羧酸根相互作用）和空间精确定位，强烈约束了脱靶反应性。

研究结论指出，研究人员开发了一类靶向BTK PH结构域的赖氨酸反应性共价修饰剂，这是此前未报道的策略。五轮结构-结合关系研究生成27个晶体结构，最佳化合物24展现出优异的靶向赖氨酸标记能力。这些修饰剂靶向肌醇磷酸结合中心的赖氨酸，抑制BTK PH结构域与PIP₃头基的结合，从而阻止BTK膜关联和激活。该工作证明了设计小分子修饰剂靶向PH结构域的可行性，为开发更强效、更选择性的BTK PH结构域抑制剂奠定了基础，同时也为更广泛地抑制PH结构域：肌醇磷脂结合提供了概念验证。