骨关节炎（osteoarthritis, OA)是一种以进行性软骨退化和滑膜慢性炎症为特征的多因素关节疾病。该疾病的一个关键标志是高分子量透明质酸（hyaluronan, HA)的耗竭，这会损害关节润滑并 perpetuates 分解代谢微环境。为了恢复内源性HA生物合成，研究人员设计了一种靶向钙黏蛋白-11 (cadherin-11, CDH11) 的pH响应型纳米载体（CMN-CDH11)，该载体基于两亲性羧甲基-己酰基壳聚糖-聚乙二醇-马来酰亚胺（amphiphilic carboxymethyl-hexanoyl chitosan-poly(ethylene glycol)-maleimide)，用于透明质酸合酶2 (hyaluronan synthase 2, HAS2) 的细胞内递送。这些纳米载体（~350 nm)利用pH触发的电荷反转机制，在pH 7.0时表面电荷为-10.88 mV，在pH 4.5时转变为+34.40 mV的正电位。共聚焦成像证实，该策略促进了内涵体逃逸，实现了酶活性HAS2的细胞质递送，从而进行后续的HA生物合成。在成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS)中的体外实验结果表明，CDH11介导的靶向作用使细胞结合力提高了2.5倍，导致HAS2表达显著上调，并分泌出重均分子量为2.05 MDa的生物活性HA。在每个分组三只动物的兔前交叉韧带切断术（anterior cruciate ligament transection, ACLT)模型中，HAS2@CMN-CDH11治疗相较于传统HA注射促进了更优的基质再生和硫酸化糖胺聚糖沉积。研究人员进一步证明，HAS2@CMN-CDH11平台在6周的观察期内将OA治疗从外源性HA补充转变为细胞介导的HA产生，突显了其作为骨关节炎治疗策略的潜力。
骨关节炎（osteoarthritis, OA)是最常见的退行性关节疾病，以关节软骨进行性降解、滑膜炎症和软骨下骨重塑为特征，导致关节润滑受损、慢性疼痛和功能障碍。随着疾病进展，关节腔内微环境日益趋向分解代谢和促炎状态，造成不可逆的结构损伤，最终可能需要进行全关节置换术。因此，早期旨在恢复滑膜稳态和延缓疾病进展的治疗干预具有重要临床意义。关节腔内注射外源性透明质酸（hyaluronic acid, HA)是恢复关节润滑和缓解骨关节炎症状的常用方法。然而，许多商业化HA制剂通常来源于微生物发酵或动物提取，由于在关节腔内受到酶降解和清除机制的影响，滞留时间相对较短，需要反复注射以维持治疗浓度。这不仅导致患者不适和依从性差，也限制了治疗的长期疗效。为了克服外源性HA注射的固有局限性，通过增强透明质酸合酶（hyaluronan synthase, HAS)来刺激内源性HA产生已成为一种有前景的替代治疗策略，可能有助于恢复关节稳态。
成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS)是通过质膜相关HAS酶（HAS1-3)在关节内产生HA的主要细胞。在这些亚型中，HAS2在生成高分子量HA方面发挥关键作用，而高分子量HA对于维持滑液黏弹性和整体关节稳态至关重要。然而，在骨关节炎中常观察到HAS2表达降低而HAS3表达升高，导致HA向低分子量方向转变，可能加剧炎症信号传导和组织降解。因此，将HAS2靶向递送至FLS是一种先进的生物工程策略，能够有效重新平衡HA代谢并重塑退行性关节腔内微环境，为骨关节炎治疗提供有前景的再生医学方法。
尽管具有治疗潜力，但实现酶活性HAS2向FLS的高效细胞内递送并使其在较长时间内保持功能活性，仍然是转化医学和概念上的重大挑战。将生物活性HAS2递送至细胞内并促进其内涵体逃逸，在设计兼具细胞类型特异性和酶功能保活性的靶向纳米载体方面提出了艰巨挑战。
壳聚糖（chitosan)作为一种天然来源的多糖，因具有优异的生物相容性、生物可降解性和黏膜黏附特性而受到关节腔内药物递送领域的关注。然而，天然壳聚糖在生理pH下溶解性差，且封装和保护不稳定生物活性分子的能力有限，这对酶递送构成重大挑战。通过羧甲基化增加亲水性和使用胆固醇及己酸酐进行疏水接枝来修饰壳聚糖，已被广泛用于增强其多功能性质。其中，羧甲基-己酰基壳聚糖（carboxymethyl-hexanoyl chitosan, CHC)通过自组装方式，对亲水性和疏水性药物均表现出高封装效率和截留效率。
为了保护不稳定的生物活性酶并实现HAS2有效细胞内递送，本研究报告了一种新型纳米自组装策略，通过羧甲基和己酰基修饰壳聚糖（CHC)并用聚乙二醇-马来酰亚胺（PEG-maleimide)功能化，首次将HAS2装载并递送至滑膜细胞以产生内源性高分子量HA。CHC聚合物主链含有可电离的氨基和羧甲基基团，使其具有pH依赖性特征，这一特性被策略性地用于促进内涵体逃逸并保护敏感的HAS2货物免受溶酶体降解。这些修饰使其在温和水相条件下自发自组装成稳定的纳米胶囊，确保HAS2的高效封装及其功能活性的保持。此外，基于壳聚糖的纳米载体（HAS2@CMN)，使用羧甲基和己酰基修饰并接枝马来酰亚胺功能化聚乙二醇（CHC-PEG-Mal)的壳聚糖，提供了表面反应性，用于位点特异性钙黏蛋白-11（cadherin-11, CDH11)配体缀合，同时不损害封装酶的活性。
CDH11是一种经典钙黏蛋白，在炎症滑膜中的FLS上高表达，在介导同嗜性黏附中发挥关键作用，提示其作为FLS选择性递送的生物学相关靶向配体的潜力。为了实现定向且稳定的表面缀合，同时保持封装HAS2的活性，研究人员使用了在C末端额外带有半胱氨酸残基的重组CDH11片段。半胱氨酸的巯基（–SH)基团通过硫醇-马来酰亚胺偶联反应，与PEG-马来酰亚胺功能化CHC纳米载体上的马来酰亚胺基团发生特异性反应。这种位点特异性、方向可控的连接保留了CDH11的N末端胞外结构域，最大程度地增强了CDH11与FLS膜上CDH11受体的同嗜性结合能力，促进了选择性细胞结合。
本研究开发的目标纳米载体系统（HAS2@CMN-CDH11)装载了HAS2并修饰有CDH11，整合了酶封装、胶体稳定性和受体介导靶向，确保了对FLS的定向和位点特异性识别与摄取，同时保持了封装HAS2的活性。研究人员假设这种靶向递送方法将刺激内源性HA生物合成，改善滑液黏弹性，并减轻骨关节炎的促炎微环境特征。该策略为骨关节炎治疗提供了一种新型壳聚糖基平台，从症状管理转向恢复内源性HA生物合成，可能改善关节稳态，尽管其靶向特异性和对滑膜病理的潜在影响需要进一步研究。
为开展本研究，研究人员使用了脱乙酰度≥90%、重均分子量约100 kDa的壳聚糖（购自C&B Co., Ltd., Taipei, Taiwan)和马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯（maleimide-PEG-NHS, MW 1000 Da; Biopharm PEG, Cat# HE022023-1K, Frankfurt, Germany)用于位点特异性缀合。合成后的CHC通过¹H核磁共振波谱（¹H NMR spectroscopy)进行结构确认。纳米载体的形貌和尺寸分布分别通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM)和动态光散射（dynamic light scattering, DLS)进行表征。采用Zetasizer测定不同pH条件下的表面电位，以评估其pH响应性电荷反转特性。酶活性HAS2通过特定的酶学检测方法进行活性测定。体外实验采用FLS细胞系进行细胞摄取、内涵体逃逸和HA合成检测。体内实验采用兔ACLT模型（每个分组三只动物)，通过组织学染色和生化分析评估治疗效果。
在材料表征与纳米载体构建方面，研究人员首先合成并表征了CHC聚合物。通过连续引入羧甲基和己酰基到壳聚糖主链上，制备了适用于酶封装和配体缀合的两亲性纳米载体。¹H NMR光谱证实了CHC的成功合成，羧甲基取代基在~4.3 ppm（OCH₂COOH)和~3.6 ppm（NCH₂COOH)处出现特征峰，而己酰基链在上行场区域（δ 0.8–2.4 ppm)显示出特征信号。
在纳米载体表征与HAS2封装方面，研究人员对CMN纳米载体进行了系统的物理化学表征。DLS和TEM分析显示，纳米载体具有均匀的尺寸分布和核壳结构形态。CMN-CDH11纳米载体的平均粒径约为350 nm，在生理条件下保持稳定。zeta电位测定结果显示，该纳米载体在pH 7.0时表面电荷为-10.88 mV，而在pH 4.5（模拟内涵体/溶酶体环境)时转变为+34.40 mV的正电位，证实了其pH触发的电荷反转机制。HAS2封装效率通过定量分析确定，封装后的HAS2保持了良好的酶活性。这些结果为后续的功能验证奠定了基础。
在细胞靶向与摄取效率方面，研究人员通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM)评估了CDH11修饰对FLS靶向性的影响。与未修饰的CMN纳米载体相比，CMN-CDH11使FLS的细胞结合力提高了2.5倍，表明CDH11介导的同嗜性黏附显著增强了纳米载体的细胞靶向性。CLSM成像进一步证实了纳米载体在细胞内的内化过程及其亚细胞分布。
在内涵体逃逸与酶活性释放方面，研究人员利用pH敏感性荧光探针和CLSM实时追踪了纳米载体的细胞内命运。结果表明，CMN-CDH11纳米载体能够有效逃避内涵体/溶酶体降解，将HAS2释放至细胞质中。释放后的HAS2保持了其酶催化活性，能够有效合成HA。
在体外HA合成功能验证方面，通过定量PCR和蛋白质印迹分析，研究人员证实HAS2@CMN-CDH11处理显著上调了FLS中HAS2的表达水平。分泌的HA通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC)进行定量分析，结果显示产生的HA具有高分子量特性，重均分子量达到2.05 MDa，符合生物活性HA的特征。
在体内治疗效果评估方面，研究人员在兔ACLT骨关节炎模型中验证了HAS2@CMN-CDH11的治疗潜力。组织学分析（包括番红-O/固绿染色和甲苯胺蓝染色)显示，与常规HA注射组相比，HAS2@CMN-CDH11治疗组表现出更优的软骨基质再生和硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycan, sGAG)沉积。这些结果表明，靶向递送HAS2能够有效促进关节组织的结构性修复。
在讨论部分，研究人员指出骨关节炎是最常见的退行性关节疾病，其特征为滑膜炎症和HA分子量降低及更快清除。本研究开发的CMN-CDH11纳米载体通过靶向递送HAS2，解决了促进内源性HA产生和抑制滑膜炎症中的生物学和理化挑战。两亲性CHC作为核心材料，通过pH响应性电荷反转机制实现了功能性酶的细胞质递送。CDH11修饰提供了FLS特异性靶向能力，而纳米载体的自组装特性确保了HAS2的稳定封装和活性保持。
在结论部分，研究人员总结道：本研究建立了一个合理设计的滑膜细胞靶向HAS2@CMN-CDH11纳米平台，用于HAS2的细胞内递送，以克服当前黏弹性补充疗法的关键挑战。通过利用CDH11介导的靶向和pH响应性内涵体逃逸，该系统确保了活性酶的有效递送，促进了内源性高分子量透明质酸合成的稳健恢复。研究人员的发现表明，这种靶向方法不仅实现了从外源性HA补充到细胞介导HA产生的转变，而且在骨关节炎治疗中展现出改善关节稳态和促进组织再生的潜力。
