DNA拓扑异构酶通过断裂和重新连接DNA链来管理基因组DNA的超螺旋结构，这是许多细胞过程的关键步骤。DNA拓扑异构酶I（TOPI）通过形成TOPI与DNA单链之间的瞬时共价键，形成TOPI-DNA切割复合物（TOPIcc）。抑制TOPI酶活性是治疗多种癌症的成功方法。酪氨酸-DNA磷酸二酯酶1（TDP1）通过催化TOPI-DNA磷酸二酯键的水解，帮助释放TOPIcc。因此，TDP1在功能上与TOPI活性相关联。聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）与TDP1发生物理相互作用，使TDP1发生PARylation（聚ADP-核糖基化），并增强TDP1被招募到DNA损伤位点，从而在TOPIcc修复中发挥功能作用。如果未修复，TOPIcc会导致单链断裂，引起细胞死亡。减慢TDP1活性可以提高现有TOPI抑制剂的疗效并改善其临床应用。阻断TDP1与PARP1之间的物理相互作用可能会对TOPIcc的修复产生负面影响。因此，阻断TDP1-PARP1复合物的形成有可能增强现有经FDA批准的TOP1抑制剂的抗肿瘤活性并减少其副作用。为实现这一目标，研究人员利用长达700纳秒（ns）的分子动力学（MD）模拟，鉴定了对TDP1-PARP1复合物形成至关重要的结合位点。研究人员确定了D115（TDP1）与K940或K943（PARP1）之间，以及R137（TDP1）与E883（PARP1）之间的特异性相互作用，这些相互作用可能对TDP1-PARP1复合物的形成很重要。研究人员利用表面等离子共振（SPR）技术验证了纯化的重组TDP1和PARP1蛋白之间的复合物形成。研究人员还使用SPR技术证实，对应于TDP1和PARP1接触点的肽段可以阻止复合物形成。研究结果为创建新型抑制剂铺平了道路，这些抑制剂可以阻止TDP1与PARP1结合，从而提高当前用于癌症治疗的TOP1抑制剂的临床疗效。
人类DNA拓扑异构酶I（TOPI）是癌症治疗的已验证靶酶，已有多种经FDA批准的药物在临床应用。TOPI与DNA单链形成瞬时共价键，并作为DNA修复机制的重要一步形成TOPI-DNA切割复合物（TOPIcc）。酪氨酸-DNA磷酸二酯酶1（TDP1）催化TOPI-DNA磷酸二酯键的水解，从而可以逆转TOPI活性。因此，TDP1在修复由被捕获在DNA链上的TOPIcc引起的DNA损伤中发挥重要作用。如果TOPIcc未被释放，可能导致DNA链断裂，进而引起细胞死亡。TOPI抑制剂已在临床使用数十年，但其使用仍面临挑战。伊立替康（一种经FDA批准的TOPI抑制剂和喜树碱（CPT）衍生物）被批准用于结直肠癌治疗；拓扑替康被批准用于治疗转移性卵巢癌、小细胞肺癌（SCLC）和宫颈癌，但这些抑制剂存在剂量限制性毒性。
TDP1与TOPI之间的功能相互作用在肿瘤细胞中起着关键作用，因此TOPI抑制剂的有效性与较慢的TDP1活性相关。在TDP1表达升高的细胞中，TOPI抑制剂CPT引起的DNA损伤较少。为了增强其修复由TOPIcc形成引起的损伤的能力，TDP1与聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）形成蛋白质-蛋白质复合物，其中TDP1被PARP1 PARylation。这种PARylation导致TDP1被招募到DNA损伤位点。因此，TDP1和PARP1之间的物理相互作用在TOPIcc修复中具有功能意义。近期及过去的研究已经利用PARP1抑制剂进行了PARP和TOPI联合抑制的研究，旨在改善癌症治疗。然而，PARP抑制剂在癌症治疗中存在毒性风险。研究人员也致力于在不抑制PARP1的情况下实现相同的目标。研究人员认为，与抑制PARP1酶活性相比，阻止PARP1-TDP1相互作用可能副作用更少。因此，开发阻断TDP1-PARP1复合物形成的新抑制剂可能提高TOPI抑制剂的疗效。对TDP1-PARP1复合物形成的适当表征和潜在结合位点的鉴定可能导致开发出阻断该复合物形成的抑制剂。
TDP1的N端结构域（NTD）与PARP的C端结构域（CTD）发生物理相互作用。然而，负责形成这种蛋白质间复合物的这两个蛋白质中的关键氨基酸残基尚未确定。在本报告中，研究人员预测了参与TDP1-PARP1复合物形成的结合位点。研究人员首先计算预测了TDP1-PARP1复合物的结构。研究人员使用这种方法来表征多种蛋白质-蛋白质相互作用。研究人员使用基于表面等离子共振（SPR）的技术在实验上验证了复合物形成。SPR是一种无标记的生物物理技术，用于研究生物分子的直接结合，研究人员已成功利用这种生物物理技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。研究人员随后通过对预测的TDP1-PARP1复合物进行长达700 ns的MD模拟来继续研究，类似于研究人员过去为其他蛋白质-蛋白质复合物进行的MD模拟。基于MD模拟的研究在药物发现研究中非常有用，包括靶点建模和蛋白质与其他结合伙伴的相互作用。基于MD模拟的结果与实验数据相结合，增强了预测结合位点的准确性和有效性。
研究结果表明，TDP1以纳摩尔（nM）级的结合亲和力与PARP1结合，并且TDP1-PARP1复合物在700 ns的MD模拟中是稳定的。研究人员对700 ns MD模拟轨迹的分析揭示了可能对TDP1-PARP1复合物形成至关重要的关键氨基酸对。研究人员还使用MM/GBSA方法计算了计算结合亲和力。SPR结果进一步证实了特定残基参与了TDP1-PARP1复合物的形成。研究人员认为，通过识别潜在结合位点对TDP1-PARP1复合物形成进行的详细表征，将为致力于开发新型抑制剂以提高TOPI抑制剂疗效的科学界提供有价值的贡献。
为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：1）基于同源建模和分子动力学模拟（MD）预测并优化TDP1与PARP1的全长结构及二者复合物结构；2）利用表面等离子共振（SPR）技术在实验上定量验证TDP1与PARP1的直接结合及特异性；3）通过分析长达700 ns的MD模拟轨迹，鉴定复合物界面的关键接触残基、氢键和盐桥；4）设计合成对应PARP1关键残基的肽段，通过SPR实验验证其阻断复合物形成的能力。本研究中的蛋白质样本（TDP1、PARP1）购自Sino Biological和Creative Biomart公司。
**研究结果与讨论**
**3.1 TDP1和PARP1结构的制备及TDP1-PARP1复合物的预测**
研究人员按照材料与方法部分概述的流程预测了全长TDP1和PARP1结构。由于全长蛋白质结构是通过建模缺失残基以及与可用晶体结构进行结构重叠来预测的，研究人员首先通过100 ns的MD模拟优化了各个全长TDP1和PARP1结构。MD模拟允许进行必要的结构灵活性和重组。图1A描绘了100 ns MD模拟结束时的TDP1和PARP1全长结构。研究人员通过均方根偏差（RMSD）测量监测了各个结构的结构完整性。如图1B所示，两个结构在约75 ns后均趋于稳定。因此，研究人员使用100 ns结束时优化的TDP1和PARP1结构来预测TDP1-PARP1复合物。图1B中，PARP1显示出更大的RMSD值。通过柔性连接子连接多个结构域的蛋白质可能导致这种较高的RMSD值，而PARP1正是一个通过柔性连接子连接的多结构域蛋白质。图1C是使用材料与方法部分提到的程序预测的全长TDP1-PARP1复合物。研究人员分析了排名第一的复合物结构，发现TDP1的N端结构域（NTD）与PARP1的C端结构域（CTD）形成了复合物。这一关于NTD(TDP1)-CTD(PARP1)相互作用形成复合物的观察结果与先前的实验预测非常吻合，因此研究人员决定使用该复合物进行后续研究。研究人员认为，当有实验预测可参考时，选择接近该预测的初始结构进行模拟，其结果更可靠。PARP1中有许多残基距离TDP1-PARP1结合界面较远。研究人员移除了这些PARP1残基（残基ID 1至495，在图1C中用深橙色表示），并制备了最终的TDP1-PARP1复合物，用于后续700 ns的MD模拟研究。这种截断非常有助于大幅减少多次副本运行的模拟时间。
**3.2 利用表面等离子共振（SPR）证实TDP1-PARP1的直接结合**
研究人员进行了基于SPR的生物物理实验以证实TDP1-PARP1的直接结合。如图2A所示，研究人员获得了TDP1与固定化的PARP1清晰直接的结合信号。PARP1被固定在CM5芯片表面。不同颜色的线条代表实验数据，显示了TDP1与固定化PARP1的浓度依赖性结合。研究人员以双份注射每种浓度的TDP1以监测技术重现性。当研究人员将实验数据（虚线）拟合到1:1结合模型时，获得了TDP1-PARP1复合物形成的平衡解离常数（K
D，亲和力）值为2.8 ± 0.5 nM，并具有较慢的解离速率常数。K
D值以三次独立分析物（TDP1）注射的平均值 ± 标准差表示。据研究人员所知，这是首次对该具有重要功能的TDP1-PARP1复合物形成的亲和力进行实验定量。研究人员还进行了对照实验，使用与PARP1相同的程序将谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为阴性对照蛋白固定在CM5芯片表面，然后注射相同浓度范围的TDP1溶液。该对照实验未显示TDP1与GST有任何结合（图2B）。这证实了研究人员获得的TDP1-PARP1结合是特异性相互作用。
**3.3 TDP1-PARP1复合物的分子动力学模拟及复合物稳定性**
研究人员对预测的TDP1-PARP1复合物进行了700 ns全原子MD模拟。长达700 ns的全原子MD模拟表明，TDP1-PARP1复合物在700 ns的模拟时间内保持稳定。图3A是700 ns MD模拟结束时的代表性TDP1-PARP1复合物结构。该结构的代表性蛋白质坐标（pdb格式）已在补充信息（SI）第S1部分提供，代表性模拟动画在第S2部分（SI）。蛋白质是柔性的生物大分子，其构象动力学对应于蛋白质的结构及功能。包括MD模拟在内的计算研究对于研究蛋白质中的构象灵活性如何帮助其容纳结合伴侣以及蛋白质与其结合伴侣复合物的稳定性非常有用。过去，研究人员已成功利用MD模拟研究了蛋白质与其结合伴侣的相互作用。
图3B显示了TDP1-PARP1复合物四次不同独立运行的RMSD测量值，蓝线代表四次不同运行的平均RMSD。RMSD值有助于评估模拟系统的更好收敛性和稳定构象。图3B中较高的RMSD值可能是由于PARP1的多个结构域通过柔性连接子连接所致，如上所述。图3B显示，尽管由于预期的初始结构重组导致早期变化较大，但在所有原子MD模拟进行约500 ns后，所有复合物结构的RMSD值均趋于稳定。研究人员还分析了复合物中TDP1和PARP1之间的质心（COM）距离，并进行了回转半径（Rg）测量，结果分别如图3C和图3D所示。相对稳定的COM距离和Rg测量也未显示出明显的结构失稳。这些结果与RMSD测量共同表明了TDP1-PARP1复合物结构的稳定性。
**3.4 TDP1-PARP1结合界面的分析及界面接触残基的鉴定**
本研究旨在探究可用于开发新型药物以增强当前靶向TOPI的抑制剂疗效的潜在TDP1-PARP1结合位点。研究人员分析了TDP1-PARP1复合物的700 ns长全原子MD模拟轨迹，以识别可能在两个蛋白质的结合界面之间建立界面接触的潜在残基。研究人员考虑了在四次MD模拟运行中至少三次形成相同残基对的情况。这些残基如图4中的棒状模型所示。表1列出了这些识别出的残基。
关注结合界面上的接触残基簇作为潜在结合口袋，对于开发阻断这两个蛋白质之间复合物形成的新抑制剂非常有用。接触区域包含位于蛋白质表面的残基，因此定义了两个蛋白质之间的结合。这些接触残基负责蛋白质之间的特异性和结合强度。因此，TDP1-PARP1结合界面上的这些界面接触残基对这两个蛋白质之间的整体亲和力有贡献。研究人员还使用与先前出版物中相同的MM/GBSA方法量化了TDP1-PARP1复合物形成的结合亲和力，计算得出有利的结合自由能为-44.3 ± 12.2 kcal mol
-1（四次不同运行的平均值 ± 标准差）。据研究人员所知，这是首次对该具有重要功能的TDP1-PARP1复合物形成的亲和力进行计算量化。
**3.5 负责TDP1-PARP1复合物形成的氢键和盐桥的确定**
研究人员分析了700 ns全原子MD模拟轨迹，以识别形成特定非共价相互作用的关键氨基酸残基。研究人员考虑了在四次副本运行中至少三次出现的相同相互作用对。研究人员发现，涉及ARG137（TDP1）和GLU883（PARP1）的残基对负责形成氢键。图5A显示了这些氨基酸残基在TDP1-PARP1结合界面上的位置。图5B显示了建立氢键的原子之间的距离-时间曲线。虚线对应于研究人员用于分析氢键的3.5 Å截止值。来自不同运行的平均值以较深的颜色显示，而单个值以相同颜色的较浅色显示。在其中一次运行中，原子间距离存在较大波动，导致图5B中氢键的平均距离-时间曲线在约600 ns之前略高于截止线，而在其他运行中结合距离低于阈值。图5B中显示的相同残基对也被预测会形成盐桥，该盐桥的残基-残基距离如图5C所示。图5B中氢键距离-时间曲线波动的相同原因也适用于图5C中该盐桥的平均距离-时间曲线在约600 ns之前略高于3.5 Å截止值的情况。研究人员还观察到TDP1中的ASP115与PARP1中的LYS940或LYS943形成盐桥。ASP115（TDP1）在三次运行中被识别出，但ASP115（TDP1）-LYS940（PARP1）或ASP115（TDP1）-LYS943（PARP1）仅在两次运行中被识别出。研究人员在三维（3D）复合物结构中分析了PARP1中LYS940或LYS943的位置，如图5A所示，这两个PARP1残基的接触区域彼此接近，可能交替或共同地与ASP115（TDP1）形成盐桥。这两个盐桥的距离-时间图如图5D和图5E所示。
**3.6 特定残基参与TDP1-PARP1复合物形成的实验验证**
如图5所示，PARP1中的三个氨基酸残基E883、K940和K943形成特定的化学键（氢键和/或盐桥）。研究人员设计了两个肽段PT-PP1-1和PT-PP1-2，并使用这些合成的肽段在实验上证实了这三个特定氨基酸的参与。需要注意的是，PT-PP1-1包含E883，PT-PP1-2包含K940和K943。PARP1中的这三个残基E883、K940和K943都位于图4所示的PARP1相互作用残基簇内。研究人员设计两个肽段而不是一个，是因为E883与K940和K943相距较远，单个肽段会过长。图6A显示了这两个肽段在3D复合物结构中的位置，它们彼此靠近。图6A还包括了这两个肽段的氨基酸序列以及在PARP1序列中对应的范围。
研究人员将100 nM TDP1单独以及100 nM TDP1与不同浓度肽段在含0.2%甘油的HBS-P缓冲液中的混合物注射到固定化PARP1的表面。如图6B所示，随着PT-PP1-1浓度的增加，SPR传感图的结合振幅（由结合阶段结束时的箭头表示）逐渐降低。对于PT-PP1-2也观察到相同的趋势，如图6C所示。研究人员将结合阶段结束时的响应值（如图6B和图6C中的箭头所示）表示为在不存在和存在肽段情况下100 nM TDP1与固定化PARP1结合的百分比，如图6D所示。研究人员将不存在任何肽段时100 nM TDP1的响应值设为100%结合。研究人员认为，如图6结果所预期，这两个肽段在溶液中与TDP1结合，导致TDP1与传感器表面固定化PARP1的结合受损，从而在任一肽段存在下均表现出浓度依赖性的TDP1-PARP1复合物形成抑制。PT-PP1-2的抑制效率似乎略高于PT-PP1-1，这可能是由于该肽段含有两个与TDP1形成特定化学键的赖氨酸，而PT-PP1-1只含有一个谷氨酸。这些结果在实验上证实了通过计算预测的、在TDP1和PARP1之间建立特定化学键的氨基酸对的参与。这些结果进一步表明，虽然其他建立TDP1和PARP1界面接触的所有氨基酸对整体亲和力有贡献，但形成特定氢键和盐桥的氨基酸残基可能对复合物的形成和稳定很重要。
总之，本研究鉴定了负责TDP1-PARP1复合物形成和稳定的潜在结合位点。在缺乏该重要功能复合物晶体结构的情况下，研究人员的调查为该研究领域开辟了进一步的途径，包括研究人员正在进行的针对TDP1-PARP1复合物的探索，以寻找能提高TOPI抑制剂疗效的新型抑制剂。
**4 结论**
TDP1-PARP1的物理相互作用在TOPIcc修复中起着关键的功能作用。阻断TDP1和PARP1之间的物理相互作用可能对TOPIcc的修复产生负面影响。鉴定潜在的TDP1-PARP1结合位点可以引领开发阻断TDP1-PARP1复合物形成的新抑制剂，这些新型抑制剂可用于增强现有TOPI抑制剂在临床中的疗效。在本研究中，研究人员尝试鉴定了形成蛋白质间复合物的潜在TDP1-PARP1结合位点。据研究人员所知，这是首次确定了关键氨基酸残基，并通过实验和计算量化了TDP1-PARP1复合物形成的亲和力值。在缺乏该具有重要功能的TDP1-PARP1复合物晶体结构的情况下，研究人员认为本研究有助于开发新型抑制剂，以增强现有TOP1抑制剂治疗癌症的疗效。
