通过优化嘌呤霉素连接子设计改进cDNA TRAP展示以增强抗体样蛋白的发现

cDNA TRAP展示（display）是一种高速体外筛选方法，可用于获得具有期望功能的抗体样蛋白（antibody-like proteins, ALPs），并且即使在严苛条件下也能够进行筛选。然而，自该方法建立以来，由于抗体样蛋白–嘌呤霉素连接子/mRNA复合物的形成效率较低（即展示效率，display efficiency），而这一参数又是决定文库多样性的关键因素，因此该方法尚未被应用于实际筛选。在本研究中，研究人员旨在通过优化嘌呤霉素连接子设计来提高展示效率。具体而言，研究评估了5′端核苷酸的修饰以及3′端嘌呤霉素基团连接位置的改变，结果使展示效率提高了1.8倍。这些发现为提升cDNA TRAP展示的性能提供了见解，并有望促进未来抗体样蛋白的发现。

该论文发表于《ChemBioChem》，围绕cDNA TRAP展示（transcription–translation coupled with association of puromycin linker）体系中展示效率偏低这一核心瓶颈，系统评估了mRNA序列与嘌呤霉素连接子（puromycin linker, PuL）设计对抗体样蛋白（antibody-like proteins, ALPs）展示性能的影响。研究背景在于，体外筛选技术已广泛用于功能肽和ALPs的获取，其中mRNA展示因可实现超过10¹³级别的超大文库多样性而被广泛采用。TRAP展示是对mRNA展示的简化和加速版本，可在重构无细胞翻译体系中仅通过加入DNA文库快速形成多肽–PuL/mRNA复合物，从而大幅缩短筛选周期。此前，该方法已被用于大环肽与ALPs筛选。进一步地，cDNA展示通过形成多肽–PuL–cDNA复合物，降低了mRNA易受核糖核酸酶（RNases）降解的脆弱性，并增强了复合物稳定性，因此能够适用于含RNases环境、活细胞靶标和碱性条件下的筛选。基于这一思路，研究人员先前开发了cDNA TRAP展示，以实现较传统cDNA展示更快速地制备ALP–PuL–cDNA复合物。

然而，cDNA TRAP展示自建立以来一直未能进入实际筛选应用，原因在于其抗体样蛋白–PuL/mRNA复合物形成效率较低。展示效率直接制约可实现的文库多样性，因此成为限制该技术实用化的关键问题。针对这一空白，本文聚焦于PuL设计优化，试图通过改善5′端核苷酸结构与序列，以及评估3′端嘌呤霉素连接位置，来提升cDNA TRAP展示的整体性能。研究结果表明，合理的mRNA序列工程与PuL结构改造能够显著提高展示效率，并使无连接（ligation）条件下的cDNA TRAP体系达到接近甚至相当于含连接步骤体系的性能，这对于简化操作流程、提高筛选效率具有直接意义。

本研究采用的关键技术方法主要包括：在重构无细胞翻译体系中构建mRNA-start与DNA-start两类展示体系；通过设计不同mRNA和PuL序列并进行退火或T4 RNA ligase介导的RNA–DNA连接，比较其对展示效率的影响；以尿素SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）定量分析多肽–PuL/mRNA复合物形成效率；利用Flexizyme体系引入biotin-Phe，并结合链霉亲和素磁珠富集与实时定量PCR（real-time PCR）开展独立的pull-down验证。研究未涉及样本队列来源，实验主体为体外分子工程与生化分析。

2.1 Improvement of Display Efficiency by Using the Optimized mRNA Sequence
研究人员首先检验了既往已被证明可提升原始TRAP展示效率的mRNA优化序列，是否同样适用于cDNA TRAP展示。具体做法是，将编码野生型monobody（第10人纤连蛋白^III型结构域，FN3）的原始mRNA-1与优化mRNA-2分别与PuL退火后，置于37°C无细胞翻译体系中反应30 min，再通过尿素SDS-PAGE检测展示效率。结果显示，mRNA-2的展示效率高于mRNA-1，由30.2%提升至38.4%。这一结果说明，UAG无义密码子邻近区域的序列工程不仅适用于原始TRAP展示，也适用于cDNA TRAP展示，并支持其可能通过抑制UAG误读（readthrough）来促进嘌呤霉素向展示蛋白C末端偶联。

2.2 Comparison of Display Efficiency between the cDNA TRAP and the cDNA Display-Based System
在确认mRNA序列优化有效后，研究人员进一步比较了无连接的cDNA TRAP系统与包含连接步骤的cDNA展示样系统之间的展示效率差异。为此，研究构建了可经T4 RNA ligase实现RNA–DNA连接的新型PuL，并设计了带有AAAAA序列末端的新mRNA-3作为连接受体。比较发现，连接体系的展示效率为33.6%，与前述经mRNA优化后的无连接体系38.4%相近，说明通过mRNA序列优化，cDNA TRAP展示即使省略连接步骤也能达到较高效率。进一步地，研究发现，当5′端5-mer由2′-OMe RNA替换为DNA时，即便不进行连接，展示效率仍可轻度提高至42.8%；而保留5′端2′-OMe RNA则未见提升。这一结果表明，PuL 5′端核酸类型本身会影响展示效率，DNA替换可能减弱不利的分子内二级结构，从而改善与mRNA的退火。

2.3 Optimization of Display Efficiency by Modifying the 5′-End Sequence of the Puromycin Linker
鉴于PuL 5′端5-mer具有显著影响，研究人员进一步考察该区域序列组成对展示效率的作用。原始序列富含G和C，虽有利于配对稳定，却也可能促进不利二级结构形成。为降低GC含量，研究将5′端序列由cccgc改为ctcta，构建了新的p-ctcta-t[PuFl]cc，并与互补mRNA-4配对。结果显示，新PuL的展示效率升至54.3%，较原始DNA型5′端PuL的42.8%进一步提高约11.5%。即使不经过连接，其效率也与含连接方法相当。这说明，通过降低5′端GC含量，可能抑制PuL和/或mRNA中不利于退火的二级结构形成，从而促进复合物生成。研究还将这一有效策略应用于原始TRAP展示，得到相同方向的效率改善，表明该设计原则具有跨体系适用性。

2.4 Evaluation of the Effect of Puromycin Moiety Placement on Display Efficiency
随后，研究人员检验了PuL 3′端嘌呤霉素基团连接位点是否会影响展示效率。原始设计中，嘌呤霉素连接于距3′端第3个核苷酸；基于缩短其与核糖体A位点距离可能增强掺入与偶联效率的设想，研究分别构建了连接于倒数第2位和倒数第1位核苷酸的两个新PuL。实验结果显示，这两种新设计并未带来显著改进，其展示效率分别为48.7%和43.2%，均低于p-ctcta-t[PuFl]cc的54.3%。因此，至少在本研究测试范围内，将嘌呤霉素连接位置向3′端移动1至2个核苷酸，并不会显著提升展示效率。

2.5 Validation of Display Efficiency Using a Pulldown Assay
为验证凝胶电泳定量所得展示效率提升的可靠性，研究人员采用独立的pull-down实验进行交叉验证。研究通过Flexizyme体系在起始密码子位置引入biotin-Phe，翻译和逆转录后，一方面再次通过凝胶电泳检测展示效率，另一方面利用链霉亲和素磁珠捕获biotin-Phe–monobody–PuL–cDNA/mRNA复合物，并以实时定量PCR定量相关cDNA。结果表明，尽管引入biotin-Phe后绝对展示效率因翻译起始效率下降而整体降低，但优化体系相对原始体系仍保持1.7倍的提升；在pull-down检测中亦观察到约1.5倍的改善趋势。由此可见，展示效率提升并非单一检测方法所致，而具有较好的重复性和方法学稳健性。

2.6 Comparison of Display Efficiencies of Each Puromycin Linker in the DNA-Start System
最后，研究人员将优化策略扩展至DNA-start体系。与需预先制备mRNA并进行退火的mRNA-start体系不同，DNA-start体系只需将DNA加入含T7 RNA polymerase的重构无细胞翻译系统，即可连续完成转录、退火、翻译和偶联，显著减少前处理步骤。实验显示，无论是将5′端5-mer由2′-OMe RNA替换为DNA，还是进一步将其序列由cccgc改为ctcta，均可在DNA-start体系中提升展示效率。尤其是前者在DNA-start中的增益更为明显，提示在缺乏预先专门退火步骤的条件下，退火动力学差异可能更显著影响整体展示结果。值得注意的是，p-ctcta-t[PuFl]cc在DNA-start体系中的展示效率达到52.2%，与mRNA-start体系中的54.3%相当。这表明，在筛选流程上可于首轮使用更有利于文库多样性的mRNA-start体系，而在后续轮次切换至更快速的DNA-start体系，以兼顾效率与操作简化。

综合讨论部分，本文的核心贡献在于首次针对cDNA TRAP展示中的PuL进行系统优化，并明确指出展示效率受两类因素共同影响：一是mRNA中UAG邻近序列，二是PuL 5′端核酸结构与序列。研究显示，优化mRNA可提高puromycin与ALP C末端偶联机会；而将PuL 5′端由2′-OMe RNA改为DNA并降低GC含量，则可能通过减少单链寡核苷酸内部二级结构、促进PuL与mRNA杂交来进一步提升展示效率。相比之下，3′端嘌呤霉素连接位点的微调并未产生额外收益。该研究的重要意义在于，将cDNA TRAP展示这一原本因低展示效率而难以实用化的方法，推进至更具应用潜力的水平；同时，优化策略在原始TRAP展示和DNA-start体系中的可迁移性，也增强了其方法学价值。由于cDNA TRAP展示能够在更严苛条件下工作，并避免mRNA稳定性不足的问题，这一改进有望促进更多具有生物学或治疗应用价值的ALPs的快速发现。

研究结论部分可译为：本研究系统考察了mRNA序列及嘌呤霉素连接子设计的多种改造，以提高cDNA TRAP展示的展示效率。首先，研究人员应用了此前已证实可提升原始TRAP展示效率的mRNA序列。对无义UAG密码子邻近序列进行工程化改造，被认为可抑制UAG密码子误读，从而促进嘌呤霉素与ALP C末端的偶联。通过该改造，研究人员成功提高了cDNA TRAP展示的展示效率，且其改进后的效率可与包含连接步骤的方法相当。其次，研究发现，PuL 5′端的5-mer核苷酸会影响展示效率。将该区域由2′-OMe RNA替换为DNA可轻度提高展示效率；进一步通过改变该区域序列以降低GC含量，则可实现额外提升。尽管其详细机制尚不明确，但新设计的PuL和mRNA可能减少单链寡核苷酸内部二级结构形成，从而促进PuL与mRNA之间的杂交。值得注意的是，该5′端改造同样提升了原始TRAP展示的展示效率。第三，研究人员基于缩短嘌呤霉素连接位点与核糖体A位点距离可能增强偶联及展示效率的假设，改变了嘌呤霉素基团的连接位置；结果未观察到展示效率提升，提示该连接位置对展示效率影响不显著。最后，研究人员评估了在较mRNA-start体系更快速的DNA-start体系中，展示效率是否同样得到改善。对PuL 5′端结构和序列的修饰产生了与mRNA-start体系相似的提升效果，且改进后的展示效率与mRNA-start体系相当。该结果支持在筛选过程中由mRNA-start体系过渡至DNA-start体系。本研究首次实现了cDNA TRAP展示中PuL的优化，并成功提高了展示效率。鉴于cDNA TRAP展示此前因展示效率相对较低而限制了实际应用，本文所述优化有望推动其在多种筛选策略中的更广泛应用。总体而言，本研究建立的改进型cDNA TRAP展示预期将加速多种适用于生物学或治疗学应用的ALPs的发现。