利用Nutella进行粪便微生物移植(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)的改良方法

摘要：小鼠粪便微生物移植(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)是一个不断发展的研究领域，通常采用强迫式的经口灌胃(Oral Gavage)，该方法对动物具有应激性和潜在伤害，且对技术人员耗时较长。自愿摄入法（如以Nutella为媒介递送）已成功用于小鼠给药，可能成为改良传统FMT技术的理想工具。以Nutella为基质的FMT有望在不影响微生物定植(Engraftment)率的前提下改善动物福利、降低工作量并提升动物安全性。本研究比较了经抗生素处理的BALB/c小鼠在三种FMT方法——经口灌胃、移液管滴喂(Pipette Delivery)及自愿摄入Nutella-菌液混合物的悬浊液——后肠道菌群的定植情况。移植前后粪便经GridION纳米孔(Nanopore) 16S rRNA基因扩增子测序分析。结果显示，Nutella基FMT与传统方法（即经口灌胃和移液管滴喂）具有相似的定植率。经口灌胃组相比移液管组表现出更大的个体间变异及与供体菌群组成的更大偏离度，且经口灌胃组与供体差异显著的菌属数量最多。单次FMT剂量在一组实验中恢复了微生物多样性，而在另一组中效果较弱，提示必要时需追加第二次FMT剂量。Nutella基FMT是一种高效、可重复且低应激的强迫喂食替代方案，值得进一步探索。

论文解读：利用Nutella进行小鼠粪便微生物移植(FMT)的改良方法研究

本研究由Ida W. Henriksen等人发表于《Clinical and Translational Science》。当前临床前研究中，小鼠粪便微生物移植(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)常采用经口灌胃(Oral Gavage)作为"金标准"，但该操作需强行固定(Scruffing)小鼠，易造成动物应激与食道损伤，且操作人员耗时较长；应激本身亦可通过脑肠轴(Gut-Brain Axis)干扰肠道微生态，引入实验偏差。已有研究表明，利用美味基质（如Nutella榛果可可酱）诱导小鼠自愿口服给药可降低应激反应。本研究旨在验证：将FMT供体菌液与Nutella混合供小鼠自愿摄入，是否在菌群定植(Engraftment)成功率、受体菌群与供体相似度(Beta Diversity, Bray-Curtis Dissimilarity)等指标上等同于或优于传统强迫灌喂或移液管滴喂法，从而提供一种符合3R原则（特别是Refinement）的FMT新流程。

主要关键技术方法

研究人员开展两项序贯实验（Study 1与Study 2），使用经抗生素（Ampicillin 1g/L饮水，7天）处理的BALB/cJBomTac小鼠（雌雄各半，4周龄）以耗竭原生菌群。Study 1设移液管滴喂组（Pipette，n=10）与Nutella自愿摄入组（Nutella，n=10）；Study 2增设经口灌胃组（Oral Gavage，n=8/组），比较三种方法。FMT供体材料Study 1为厌氧新鲜瑞士韦伯斯特(Swiss Webster)小鼠粪球混生理盐水+10%甘油，Study 2为单只BALB/c雌鼠盲肠内容物(Cecum Content)冻存于10%甘油/PBS。Nutella组菌液与Nutella按1:4体积比混合，涂于塑料隧道内壁供自愿舔食；移液管组在固定下滴100μL菌液入口腔；灌胃组用金属灌胃针给予100μL菌液。移植前4天所有鼠预喂纯Nutella使其适应口味。分别于抗生素处理前、FMT前及终末（FMT后14天）收集粪便。粪便DNA采用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取，近全长16S rRNA基因扩增子经GridION（Oxford Nanopore Technologies）测序，生物信息学分析使用LACA流程及SILVA数据库进行物种注释，phyloseq包计算Alpha多样性(Shannon Index)、Beta多样性(Bray-Curtis)及OTU共享率（定植率），DESeq2做差异丰度分析， vegan包做距离冗余分析(dbRDA)及方差分散性检验(betadisper)，统计检验含Welch t检验、ANOVA及Tukey事后检验。

研究结果

3.1 FMT Using Nutella Was Practically Successful and Time Saving（利用Nutella进行FMT实际操作可行且省时）

大多数小鼠对Nutella-菌液混合物表现出高度兴趣，5–15分钟内吃完，少数需30分钟；可整笼同时给药并直接在操作笼收集粪便，避免了强迫保定及单独抓取取粪的应激。缺点是需提前适应口味及后续器具清洁稍多。结论：Nutella介导的自愿摄入法在实际操作中简便可行，具时效优势。

3.2 FMT Using Nutella Resulted in Similar Engraftment Rate as With Forced Feeding（Nutella基FMT获得与强迫喂食相当的菌群定植率）

Study 1中，Nutella组与移液管组FMT后Alpha多样性(Shannon Index)均恢复至相近水平，与供体共享OTU频率（定植率）无组间差异且均较FMT前显著升高。Bray-Curtis距离至供体组成两组无显著差异(p=0.7)。dbRDA显示采样时间点解释变异最大，FMT方法影响较小但有显著性，两组群落在FMT后未形成显著性分离（置换检验纯边分布无差异）。差异丰度分析仅发现极少量菌科/菌属在两组的微小差别（如Nutella组Alloprevotellaceae和Muribaculaceae略低，Rikenellaceae和未定种Prevotellaceae略高）。结论：Nutella自愿摄入与移液管强迫滴喂在菌群恢复多样性、定植率及整体群落相似性上效果等同。

3.3 FMT Using Oral Gavage Resulted in Higher Variability and a Gut Microbiota Composition More Distinct From the Donor Profile（经口灌胃FMT导致更高变异性及与供体菌群更大偏离）

Study 2中三组Alpha多样性均未完全恢复（可能与供体材料为长期冻存盲肠内容物有关），但三组间无差异；定植率三组也无差异。然而经口灌胃组围绕dbRDA质心的离散度(betadisper)显著大于移液管组，且与供体的Bray-Curtis距离显著大于移液管组（Nutella组与另两组无显著差异）。差异丰度分析显示，经口灌胃组与供体差异显著的菌属数最多（15个 vs Nutella组13个 vs 移液管组10个），特征性表现为Clostridiales目下的Ruminococcus和Subdoligranulum减少、Lactobacillaceae科的Limosilactobacillus增加，模式与文献报道应激致菌群改变一致。结论：经口灌胃因操作应激可能引致受体肠道菌群组成更大波动及与供体偏离，而Nutella法与移液管滴喂在此方面不劣于传统金标准。

讨论与结论

研究人员指出，Nutella基FMT定植率约70%–75%，与传统方法相当。经口灌胃组较大变异与偏离可能源于灌胃束缚应激经脑肠轴重塑菌群（如Clostridiales减少、Lactobacillaceae增加），此现象未见于Nutella及移液管组。Study 2未能完全恢复Alpha多样性被归因于供体材料差异（单鼠盲肠冻存一年 vs 双鼠新鲜粪便厌氧制备），特定难定植菌（如Prevotellaceae、Bifidobacteriaceae）的存在可能影响结果，必要时建议二次给药。Nutella高糖高脂基质可能导致少数纤维依赖严格厌氧菌（如Monoglobus、Agathobacter）丢失，且混入Nutella后立即投喂以限制接触时间，巧克力成分甚至可能通过缓冲胃酸保护益生菌。局限包括所有鼠预接触Nutella故无法单独评估Nutella饮食效应、未设无Nutella对照、未测直接福利指标（皮质酮等），未来需补充。此外，本研究为小鼠-小鼠FMT，人源FMT定植率通常更低，尚需验证推广可能。

研究结论（翻译自原文Conclusion）：

综上所述，利用Nutella递送FMT在实际操作中可行，且获得的菌群定植率与传统的强迫喂食方法相当。但Nutella饲喂对微生物及生理的潜在影响仍需进一步探究，其福利改善意义亦有待明确证实。这些初步结果强烈鼓励对该方法进行更深入的探索。