在黑曲霉（Aspergillus niger）中利用室温大气压等离子体进行诱变处理，并实现右旋糖酐酶（dextranase）的异源表达

摘要

葡聚糖酶（DEX）是一种高价值的生物催化剂，在口腔卫生和多种工业生物过程中具有巨大潜力，但其实际应用常常受到野生型菌株产量不足的限制。在这项研究中，通过结合常压和室温等离子体（ARTP）诱变、分子机制阐明以及宿主特异性启动子工程的综合策略，建立了一种高效的DEX生产系统。分离出一种稳定的突变体Chaetomium gracile B12，其DEX活性比亲本菌株提高了30.6倍（达到16.23 U/mL）。序列分析和多尺度计算模拟（包括基于AlphaFold2的建模和100纳秒分子动力学模拟）提出了一个可验证的假设：这种突变可能促成了活性的增强。研究发现，该突变增强了酶的结构刚性，并优化了底物在活性口袋内的空间定位，从而促进了催化反应的“高效对齐”。此外，异源表达优化揭示了宿主特异性启动子的偏好：异源的Pcdna1启动子在C. gracile中表现最佳，而内源的可诱导启动子PgpdA在Aspergillus niger中更为有效。值得注意的是，这种在A. niger中首次实现的DEX异源表达显著缩短了生产周期，将发酵时间从6天缩短至48小时。通过对碳源/氮源和通气强度进行系统优化后，工程改造的A. niger菌株H的DEX活性峰值达到了36.00 U/mL。生化表征表明，重组DEX具有适宜的接近中性的最佳pH值（6.0–7.0）和50°C的最佳温度。总体而言，本研究首次实现了在A. niger中的葡聚糖酶异源表达，将发酵时间从6天缩短至48小时，并提供了一种全面的葡聚糖酶过量生产策略，同时提供了关于酶“微调”的分子机制见解，从而获得了一种高滴度、中性pH值兼容的生物催化剂，其在口腔护理和工业应用中具有巨大潜力。