卵菌致病疫霉是一种有害的病原体，目前主要依赖大量施用合成农药进行控制。鉴于农药的毒性，生物防治代表了一种对抗该病原体的有吸引力的替代方案。假单胞菌菌株以产生多种专化代谢物而闻名，这些代谢物可保护作物免受多种疾病侵害。除了引起直接病原体抑制的分子（如抗生素和毒素）外，铁载体（siderophores）被认为是假单胞菌通过竞争性抑制病原体的重要介质。然而，铁载体产生在致病疫霉的生物防治中是否发挥作用尚未被研究。在本研究中，研究人员聚焦于两株假单胞菌菌株，即董氏假单胞菌（Pseudomonas donghuensis）R32和绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）R47，两者均产生铁载体吡咯菌素，并且先前已被鉴定为致病疫霉的抑制剂。本研究的目的是评估吡咯菌素在这两株菌株抑制致病疫霉过程中的作用。为此，研究人员通过敲除编码周质铁载体输出蛋白的pvdE基因，在两种野生型菌株及其氰化氢（HCN）缺失突变体中构建了吡咯菌素缺陷突变体。随后，这些突变体在不同的体外实验以及叶盘实验中被测试了对致病疫霉的拮抗活性。研究结果表明，吡咯菌素在董氏假单胞菌R32抑制致病疫霉的过程中不起作用，在绿针假单胞菌R47中仅起次要作用，且仅在叶盘实验中观察到。尽管如此，研究发现证明了铁竞争在董氏假单胞菌R32对致病疫霉的拮抗效应中起着重要作用，并提示了另一种铁载体参与了铁的竞争。
作物暴露于多种可导致严重产量损失的病原体中。尤其是在马铃薯中，致病疫霉在全球范围内是一个极具挑战性的病原体。这种卵菌可引起茄科作物的晚疫病，能在短短10-15天内摧毁一个马铃薯田块。由于其快速进化、高适应能力和快速的无性繁殖周期（涉及两种孢子类型：在较温暖条件下直接萌发的孢子囊，以及在较冷温度下从孢子囊释放的可动游动孢子），它被视为对马铃薯威胁最大的病原体。当前的作物保护措施严重依赖于铜基和合成农药，后者不仅有毒，而且对于像致病疫霉这样快速进化的病原体容易产生抗性。相比之下，生物防治剂（指用于保护作物的微生物）由于其多靶点作用模式，不太可能引发病原体的抗性发展。在细菌中，这些作用模式可以包括诱导植物抗性，或更直接的机制，如抗生作用和对资源与空间的竞争。后者也包括对铁的竞争，尽管铁在环境中丰度很高，但由于其在三价状态下不溶于水，从土壤中难以获取。微生物能够产生称为铁载体的铁螯合分子，使它们能够从土壤中获取这种不溶性离子，并使它们成为强大的铁竞争者，这一特性已被证明在微生物竞争中起着重要作用，并且特别适用于植物病原体的生物防治。
该研究团队先前的研究集中在两株对控制晚疫病有前景的假单胞菌菌株上：董氏假单胞菌R32和绿针假单胞菌R47。两株菌株对致病疫霉的不同发育阶段（菌丝、孢子囊和游动孢子）均显示出强烈的抑制活性。比较基因组学方法鉴定出这两株菌株中推定的生物防治性状和机制，其中包括绿针假单胞菌R47产生吩嗪（phenazines），以及两株菌株都产生氰化氢（HCN）和吡咯菌素。HCN在这两株菌株抗卵菌活性中的作用先前已被研究，并被证明影响菌丝生长，但不影响孢子萌发，也不影响叶盘中的疾病进展。相比之下，吡咯菌素对于抗卵菌活性的重要性尚未被评估，尽管先前有报道指出其与生物防治相关。
吡咯菌素首次在1978年被描述为一种铁载体。此后，许多研究揭示了其在铁螯合以及在不同生物学背景中作为毒力因子的重要性。已知吡咯菌素的生物合成在不同的假单胞菌种类和菌株之间存在差异，并反映在大量不同结构中。通常，吡咯菌素由一个二羟基喹啉荧光团、一个连接在其3-氨基上的可变酰基侧链以及一个连接到荧光团C1羧基上的菌株特异性肽骨架组成。生物合成始于细胞质中，主要由3-4个非核糖体肽合成酶（NRPS）和一系列辅助酶组装吡咯菌素的前体——铁杆菌素（ferribactin）。NRPS的确切数量和身份可能因菌株而异，但PvdL是所有物种中唯一保守的，并且是合成的起点。然后，铁杆菌素通过位于内膜上的ATP结合盒（ABC）转运蛋白PvdE被转运到周质空间。在那里，前体经历由PvdQ介导的双酰化，最后形成特征性的荧光团。这种未成熟的吡咯菌素经过修饰，直到最终由三部分转运蛋白PvdRT-OpmQ输出，从而可以在细胞外充当铁螯合剂。铁吡咯菌素再次通过外膜受体FpvA导入周质空间，该受体对吡咯菌素的菌株特异性结构具有特异性。然后它从铁离子上脱离并再次输出到细胞外。
吡咯菌素的合成主要通过胞质Fur调节因子受铁可用性的调节。在低铁条件下，抗σ因子FpvR以及σ因子FpvI和PvdS不再被Fur抑制。虽然FpvR抑制这两个σ因子（它们本身激活吡咯菌素合成和摄取基因），但它在遇到铁结合的FpvA时会自动蛋白水解。这种机制确保了在铁饥饿状态下的正反馈，但也允许在有足够铁时关闭合成。已知根据菌株的不同，吡咯菌素合成可由全局调节因子GacS/GacA、不同的营养可用性（如硫或磷）或其他毒力因子在复杂的调控网络中调节。
尽管已知铁载体总体上，特别是吡咯菌素，在植物疾病的生物防治中发挥作用，但吡咯菌素对抗卵菌假单胞菌菌株的抗卵菌特性的贡献程度仍然未知。为填补这一知识空白，研究人员在这两株假单胞菌生物防治菌株（董氏假单胞菌R32和绿针假单胞菌R47）中构建了吡咯菌素突变体。除了单基因敲除（KOs）外，研究人员还对HCN和吡咯菌素进行了双基因敲除，以避免吡咯菌素的潜在影响被HCN对致病疫霉的影响所掩盖。研究人员选择了编码周质铁杆菌素输入蛋白的pvdE作为诱变靶点，因为已有报道称该程序可消除铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中的吡咯菌素产生。随后，研究人员在体外实验中表征了这些突变体抑制致病疫霉不同发育阶段的能力，以及它们在叶盘中对疾病进展的影响，以量化吡咯菌素对这两株假单胞菌菌株对致病疫霉抑制效应的贡献。
为评估铁载体产生对董氏假单胞菌R32和绿针假单胞菌R47抗卵菌活性的影响，研究人员通过在野生型和HCN缺失突变体背景下删除pvdE基因构建了吡咯菌素突变体。该突变不影响菌株在富养培养基LB中的生长，在铁贫瘠的KB培养基中仅略有影响，而只有R32的双突变体在V8培养基中显示出降低的生长。当在这些培养基中补充FeCl₃时，它使两种菌株的突变体和野生型基因型在铁可用性较低的培养基（KB和V8）中的生长条件趋于一致。对于原本铁含量丰富的LB培养基，添加外源铁甚至导致董氏假单胞菌R32的pvdE单突变体和双突变体都具有生长优势。另一方面，当在这些培养基中添加铁螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）时，研究人员观察到所有吡咯菌素突变体基因型在LB中的生长严重受损，在KB和V8中的生长也减少，尤其是双突变体。研究人员推测，不同培养基中的铁对EDTA添加的反应方式不同，因为在V8和KB中，铁可能已经形成复合物，而在LB中则不然，因此在后者中可能被添加的EDTA完全捕获，因此对吡咯菌素突变体来说可获得性更低。
正如预期的那样，通过荧光发射显示的吡咯菌素水平在两种菌株的单突变体和双突变体中在KB培养基中和过滤的V8培养基中均显著降低，尽管在董氏假单胞菌R32中产生并未完全消除。在R32中观察到的吡咯菌素发射水平高于R47，并且在单Δhcn突变体中高于相应的野生型菌株，如先前报道。这在董氏假单胞菌R32的液体培养吡咯菌素测量中以及绿针假单胞菌R47固体培养板上发射的紫外（UV）荧光中均可见。为了获得超越吡咯菌素测量和荧光分子可视化的铁载体产生的更广泛视图，研究人员在CAS平板上培养了八种基因型，铁载体介导的铁耗竭可以在CAS平板上通过橙色光晕可视化。与预期相反，研究人员未观察到吡咯菌素荧光测量值与橙色光晕大小之间存在明确关联，这表明该光晕是由一种或多种其他铁载体的分泌介导的。
在补充了不同浓度FeCl₃的KB培养基中，吡咯菌素产量随着铁缺乏而增加，但两株菌株之间存在差异：董氏假单胞菌R32随着铁浓度的增加逐渐减少其吡咯菌素产量，但在测试的最高铁供应（27 mg·L⁻¹）下仍产生可检测量的吡咯菌素；而绿针假单胞菌R47在培养基中提供1 mg·L⁻¹铁时就已停止产生吡咯菌素。
在未添加铁的V8培养基中，研究人员未观察到单ΔpvdE突变体相对于野生型菌株的活性显著丧失。当所有绿针假单胞菌R47突变体保持了野生型的全部抑制潜力时，在董氏假单胞菌R32中观察到轻微的调节，单Δhcn突变体活性有小幅但显著的下降，双突变体则部分恢复了野生型表型。添加逐渐增加浓度的铁并未损害绿针假单胞菌R47抑制菌丝生长的能力，表明铁竞争不涉及此过程。相比之下，董氏假单胞菌R32的野生型和突变体菌株都随着铁供应的增加而丧失了部分活性，这表明观察到的部分抑制潜力是由于致病疫霉的铁剥夺所致。这在缺乏HCN时最为明显。然而，ΔpvdE突变体并未表现出比其相应对照（野生型vs.单Δhcn突变体）更严重的活性丧失，如果吡咯菌素在铁获取中起作用的话，本应如此。相反，双基因敲除似乎独立于铁补充恢复了野生型的部分抑制潜力，这表明当HCN和吡咯菌素均不再产生时，可能存在一个未知因子的上调，从而导致菌丝生长受限。
值得注意的是，研究人员观察到董氏假单胞菌R32及其相应的突变体在补充了高浓度铁的平板上生长时积累并分泌一种 reddish 分子，这种现象在董氏假单胞菌R32的单HCN突变体中最为强烈。在绿针假单胞菌R47中，未观察到该分子的分泌，仅在HCN突变体和双突变体的最高铁浓度下略微颜色变深。在两种菌株中都观察到的一个表型是菌落直径随着铁浓度的增加而减小，这可能是由于铁添加导致的琼脂密度增加，并且与毒性无关，因为即使在最高铁剂量下，通过CFU计数揭示的细胞数量也没有减少。
除了菌丝生长抑制，研究人员分析了吡咯菌素是否在抑制游动孢子释放、游动孢子萌发和孢子囊萌发方面发挥作用。由于孢子生理在不同病原体菌株之间比菌丝生长表现出更高的变异性，研究人员分析了三种不同的致病疫霉基因型。对三种菌株获得了相似的结果，因此研究人员仅展示GFP标记菌株的结果。
总的来说，与董氏假单胞菌R32相比，绿针假单胞菌R47显示出非常微弱的孢子抑制潜力，后者即使在低细胞密度下应用也显示出强烈的抑制，尽管在这些低密度下结果相当多变。在游动孢子释放和萌发中，在测试的两种浓度下，绿针假单胞菌R47的突变基因型相对于野生型均未观察到活性的显著变化。虽然不显著，但研究人员仍可以在绿针假单胞菌R47的HCN单突变体和双突变体中观察到拮抗活性增强的趋势。
在董氏假单胞菌R32中，两种单突变体都保持了其全部抑制潜力，抑制丧失仅在双突变体中观察到。对于游动孢子释放，在较低细菌浓度下仅为趋势的效果在较高浓度下变成了抑制的显著丧失，经双基因敲除处理的孢子囊几乎达到了与水对照相同的游动孢子释放水平。关于游动孢子萌发，在两种测试浓度下，双突变体与所有其他董氏假单胞菌R32基因型之间的差异由于重复之间的高度变异性而没有统计学意义，但可以看到相同的活性降低趋势。由于两种单突变体均未检测到抑制丧失，这一结果表明两种生物防治性状之间存在相互作用或冗余效应。
孢子囊萌发呈现了对比鲜明的图景，无论是R32还是R47，野生型和突变体之间在萌发百分比上均未观察到差异。当观察芽管长度时，无论是吡咯菌素的丧失还是HCN的丧失都不影响董氏假单胞菌R32的抑制能力，而对于绿针假单胞菌R47，两种单Δhcn突变体和双Δhcn突变体均显示出比野生型更高的活性，这表明在缺乏HCN时，其他活性化合物的表达上调。
由于叶盘感染是用直接与细菌接触的游动孢子进行的，研究人员期望获得与体外游动孢子萌发实验相似的结果。令人惊讶的是，结果显示出与体外实验相反的趋势，强调了体外和体内实验条件的差异。在董氏假单胞菌R32中，pvdE单突变体与野生型相比显示出对致病疫霉保护的显著增加，无论是观察病斑大小还是菌丝体发育。双突变体与野生型相比也显示出显著更高的保护性，但与Δhcn相比则没有，因为该突变体已经显示出更高保护性的趋势。这些发现表明，在缺乏HCN和吡咯菌素时，一种或多种其他生物防治性状的表达上调。对于绿针假单胞菌R47，研究人员观察到所有突变菌株与野生型相比完全丧失了保护活性。在这种情况下，HCN和吡咯菌素似乎参与了叶盘对抗致病疫霉的保护。
为了排除不同保护活性可能是由于在感染实验过程中在叶盘上差异存活所致，研究人员量化了不同菌株在叶盘上一周后的存活情况。所有基因型不仅存活了七天，而且甚至能够生长。基因型之间的存活率没有显著差异，尽管R32的吡咯菌素单突变体和双突变体有增殖最少的轻微趋势。
为了评估吡咯菌素在两株假单胞菌菌株针对致病疫霉的生物防治活性中的重要性，研究人员在野生型和HCN缺失突变体中敲除了pvdE基因。尽管有报道称在铜绿假单胞菌中敲除该基因可阻止吡咯菌素的产生和积累，但研究人员只能在两株菌株中的一株中实现相同的效果。在董氏假单胞菌R32中，单pvdE突变体和双突变体仍然显示出减少但可测量的吡咯菌素水平，大约相当于绿针假单胞菌R47中的野生型水平。虽然在KB培养基中与R32野生型水平相比仍显著减少（约7倍），但问题在于为什么研究人员无法在该菌株中实现吡咯菌素的完全耗竭。尽管在恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）中发现了另一种三部分吡咯菌素分泌泵，甚至有证据表明存在更多离开周质空间的方式，可能是多药外排系统，但目前尚未知有任何转运蛋白能够接替PvdE的功能将铁杆菌素转运至周质空间。PvdE是MacB的同源蛋白，MacB家族已知在假单胞菌中转运毒素和铁载体，因此研究人员在董氏假单胞菌R32的基因组中寻找其他MacB同源蛋白，但没有发现。由于合成在不同假单胞菌菌株之间可能存在差异，因此不能排除存在未知转运蛋白，甚至自发扩散的可能性。有趣的是，另一项关于铜绿假单胞菌pvdE突变体的研究导致琼脂平板上的荧光减少但仍然可见。在评估了吡咯菌素荧光团在400 nm处的典型吸光度后，他们确定琼脂平板上剩余的荧光来自其他分子。在研究人员的案例中，这种可能性被排除了，因为pvdE突变体上清液酸化后的吸光度也发生了偏移，与野生型类似。
研究人员先前也敲除了董氏假单胞菌R32中的PvdQ，这是一种在周质空间作用于铁杆菌素的酶。有报道称突变该基因可阻止成熟、荧光和功能性吡咯菌素的合成，然而研究人员对R32 pvdQ突变体的荧光测量显示其荧光水平与野生型相当，因此研究人员决定继续使用pvdE突变体进行工作，假设吡咯菌素水平降低7倍足以评估吡咯菌素在该菌株抗卵菌活性中的相关性。在补充了EDTA的LB培养基中的生长曲线证实了研究人员的突变体具有显著的表型，因为两种菌株的单突变体和双突变体在LB中的生长几乎完全被抑制。EDTA似乎螯合了LB中先前自由可用铁的全部池。只有吡咯菌素（在铁载体中对铁具有不常见的高亲和力）才能获取这种EDTA结合的铁池，从而使菌株能够正常生长。pvdE突变体中存在的其他铁载体似乎对铁的亲和力低于EDTA，因此不允许菌株获取正常生长所需的铁。研究人员推测，与LB不同，KB和V8在添加EDTA之前就已经存在一个可螯合的铁池，吡咯菌素突变体仍然可以获取，从而导致生长减少但仍然显著。
在KB液体培养中测量吡咯菌素特异性荧光水平时，研究人员可以清楚地观察到R32中的吡咯菌素含量高于R47。相反，在荧光图片中，研究人员可以看到R47的荧光强度比R32更显著。在广谱紫外光下，其他分子也会发出荧光，这解释了观察到的差异。
有趣的是，所有四种pvdE突变体中吡咯菌素水平的降低在荧光平板上可见，但未反映在CAS实验中光晕大小的显著减小上，这清楚地表明R32和R47除了吡咯菌素外，可能分泌一种或多种未知的铁载体。对于董氏假单胞菌R32，研究人员确实发现了一个铁载体的生物合成基因簇，在先前对该菌株基因组的分析中未被检测到：7-羟基卓酚酮（7-hydroxytropolone，7HT）。这种小分子是一种已知的铁载体，不具有荧光性，但在CAS平板上可见，这与上述发现非常吻合。据报道，7HT是其他董氏假单胞菌菌株抗菌活性的驱动因素。最近的一项研究甚至表明，7HT对于抗卵菌活性很重要，因为其菌株的HCN和7HT双基因敲除突变体抑制卵菌的能力降低。这强烈表明董氏假单胞菌R32也使用7HT来抑制致病疫霉，并且这种铁载体可能在pvdE突变体中接管了铁螯合活性。吡咯菌素和7HT的冗余铁竞争机制也可能解释了为什么缺乏吡咯菌素没有损害研究人员菌株抑制致病疫霉的能力，这与研究人员先前的预期相反。研究人员知道7HT和吡咯菌素在不同的董氏假单胞菌菌株中以多种方式相互关联。有观点认为它们具有互补作用：7HT是一种低成本的小铁载体，但铁亲和力中等；而吡咯菌素则相反。这种相互作用允许细胞平衡铁获取需求和代谢成本。这一点在两种生物合成途径都受GacS/GacA级联调节，而只有吡咯菌素受铁摄取调节因子（FUR）调节的事实中得到了强调，这使得在细胞需要铁时能够强烈上调。两者也受全局应激σ因子SigW的影响；它降低了7HT的产生，同时允许在铁应激条件下合成吡咯菌素。尽管有报道称在这种菌株中敲除7HT的产生并不影响吡咯菌素的合成，但在另一种菌株（P482）中观察到了相反的情况，即一种铁载体的合成似乎是另一种铁载体合成的前提。为了更深入了解它们对董氏假单胞菌R32抗卵菌活性的互补或冗余作用，需要构建两种铁载体的双基因敲除突变体。
在绿针假单胞菌R47的情况下，评估吡咯菌素对菌丝生长抑制的影响很困难，因为所有突变体在所有铁补充水平下都保持了高抑制活性。这很可能是由于绿针假单胞菌R47产生的吩嗪，已知吩嗪是有效的生物防治相关分子，并且先前已被证明可以限制致病疫霉的菌丝生长。因此，吡咯菌素的潜在影响可能被该菌株中存在的吩嗪所掩盖。
评估吡咯菌素对绿针假单胞菌R47抑制致病疫霉孢子相关发育阶段的贡献也同样困难，这次是由于相反的原因——野生型即使在比董氏假单胞菌R32更高的细胞密度下使用，也表现出非常微弱甚至没有活性。这种缺乏活性与早期实验不同，但在八个生物学重复和所有三个测试的病原体基因型中都是稳定的。然而，尽管研究人员没有观察到暴露于绿针假单胞菌R47的孢子囊萌发百分比有任何显著降低，但芽管的长度在接触绿针假单胞菌R47野生型时显著减少。缺乏吡咯菌素并未影响这种活性，与缺乏HCN相反，缺乏HCN在单突变体和双突变体中都增强了这种活性，这表明参与抑制芽管伸长的另一种性状的表达上调。
相比之下，在绿针假单胞菌R47及其突变体中获得的体内结果清楚地显示了吡咯菌素和HCN对疾病控制的影响：虽然野生型成功保护了叶盘免受病斑和菌丝体形成的影响，但所有三种突变体都丧失了保护活性，这表明两种性状都是体内保护的重要决定因素。单突变体并非比双突变体更有效，而不是部分丧失保护。这可以由吡咯菌素和HCN的调节相互依赖性来解释。虽然HCN的丧失预计会导致更高的吡咯菌素水平，但研究人员只在董氏假单胞菌R32中观察到了这一点，而在本研究中的绿针假单胞菌R47中没有观察到。研究人员不知道缺乏吡咯菌素是否会影响叶盘上的HCN排放。由于两种分子都具有结合铁的能力，并且HCN排放量在铁充足条件下更高，缺乏吡咯菌素导致的铁可用性降低可能对HCN排放产生了影响。或者，两种分子可能具有冗余的铁螯合或铁感知功能，这也解释了单突变体和双突变体之间功效的缺乏差异。这三种突变体都缺乏保护的事实也表明，吩嗪可能在体内抑制菌丝发育方面不如在体外重要，这种趋势先前已被观察到。更重要的是，研究人员在本实验中观察到吡咯菌素突变体生物防治活性的丧失，首次突出了这种铁载体对于控制马铃薯晚疫病的某种相关性。在董氏假单胞菌R32中没有观察到这种效应的事实，可能是由于上述另一种铁载体的存在。
对于董氏假单胞菌R32，获得的结果呈现不同的情况，这凸显了这两株菌株虽然都是具有抗卵菌活性的假单胞菌，但可能采用了不同的作用模式。在低铁条件下（未添加FeCl₃）的菌丝生长抑制中，吡咯菌素的强烈减少对两种单突变体和双突变体的抑制水平没有影响。这表明尽管铁竞争在相互作用中起作用（从铁补充增加时观察到的抑制降低可以明显看出），但吡咯菌素本身与菌丝生长抑制无关。更重要的是，如果吡咯菌素对于抑制病原体的这一阶段很重要，我们期望看到HCN丧失（导致Δhcn突变体活性降低）和吡咯菌素丧失的累积效应，但我们测量到的是双突变体相对于Δhcn突变体活性显著增加，且与铁补充无关。这种抑制的增加可以解释为一种或多种其他生物防治性状（如上述提出的7HT）的表达上调。
观察添加了铁的平板时，研究人员看到董氏假单胞菌R32及其突变体分泌一种 reddish 分子。由于研究人员在培养基中外部添加了大量的FeCl₃，但没有检测到对细菌生长的毒性作用，研究人员可以想象这种红色分子要么是氧化的三价铁，被细菌溶解后再次分泌出来，要么甚至是一种防止铁介导氧化应激的色素，比如已知由粘质沙雷氏菌（S. marcesens）产生的灵菌红素（prodigiosin），具有缓解这种氧化应激的功能。菌落也变得更小更厚，这种形态变化的现象也在铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）中观察到，铁添加触发了生物膜形成的增加。
在游动孢子释放和游动孢子萌发方面，吡咯菌素的强烈减少并未降低董氏假单胞菌R32的活性，HCN的丧失也没有。然而，两种生物防治性状的丧失确实导致了抑制活性的强烈降低甚至完全丧失，这表明两种性状在单独存在时都足以有效抑制游动孢子，而其他性状在此过程中不起作用或只起非常微小的作用。另一个可以解释研究人员发现的假设是，在吡咯菌素单突变体的情况下，HCN使生长培养基酸化，甚至充当弱有机螯合剂，因此细菌可以更容易地获取铁，尽管吡咯菌素水平强烈降低。这也解释了为什么需要在单HCN突变体中产生更多的吡咯菌素。在双突变体中，吡咯菌素介导的螯合和铁介导的酸化都会缺失，这可以解释在游动孢子释放和萌发实验中观察到的更强烈的活性丧失。
研究人员期望叶盘实验的结果能够反映体外游动孢子萌发实验的结果，但令人惊讶的是情况并非如此：pvdE的单突变体和双突变体都比董氏假单胞菌R32野生型提供了更高的保护，这再次表明另一种铁载体（推定为7HT）的参与。
在研究人员的大多数发现中，吡咯菌素作为假单胞菌和致病疫霉之间铁竞争介质的重要性很小，绿针假单胞菌R47在叶盘实验中的保护能力除外。这是令人惊讶的，因为吡咯菌素以其对铁的特别高亲和力而闻名，并且被认为是荧光假单胞菌铁获取的主要机制。它在多项研究中也被报道为拮抗作用的主要驱动因素。然而，重要的是要记住这些研究的背景，例如目标病原体或实验设置。例如，Liu等人观察到吡咯菌素是其假单胞菌菌株在铁饥饿条件下抗菌活性的主要驱动因素，但在非饥饿条件下，吡咯菌素对于活性不再相关。在Ran和Gu等人的研究中，尽管假设吡咯菌素是所观察到的拮抗作用中铁竞争的主要驱动因素，但他们在两种情况下测试的突变体都缺乏两种铁载体，因此难以得出关于吡咯菌素具体作用的结论。Maldonado-González等人也报告了这个问题，他们无法排除存在另一种铁载体的可能性，该铁载体可能在缺陷突变体中取代了吡咯菌素的功能，从而维持了其生物防治活性。其他研究报告称，虽然分析的模式菌株产生吡咯菌素，但它并不是该菌株生物防治活性的主要作用机制。这并不意味着吡咯菌素，以及一般的铁载体，不是重要的生物防治性状，而是表明它们的作用强烈依赖于外源铁水平、菌株产生的其他代谢物、寄主植物和目标病原体。
同样，吡咯菌素在研究人员的两株假单胞菌菌株抗卵菌活性中的有限作用并不意味着吡咯菌素对于菌株中的其他功能不重要。在多次生物测定中，研究人员观察到当吡咯菌素，或吡咯菌素和HCN同时被敲除时，生物防治活性增加。类似于研究人员先前发现HCN不仅是一种毒素，还是一种信号分子，有证据表明吡咯菌素的丧失对R32整体生物防治活性产生了间接影响，可能是由于细菌中降低的铁浓度触发了其他生物防治性状的表达上调。
铁是细菌整个调控网络的重要决定因素。吡咯菌素不仅可能用于获取铁，还可能有助于细菌细胞内的铁稳态。这意味着吡咯菌素可能间接参与假单胞菌菌株的调控网络。这一假设得到了吡咯菌素在生物膜形成和群集运动中具有重要作用的事实的支持。Matilla等人甚至提出，吡咯菌素可能被用于一种类似于群体感应的机制，其中铁是信号分子，而吡咯菌素是传感器。无论如何，缺乏吡咯菌素导致更高的拮抗活性的反复观察表明，铁感知和稳态的变化可能调节拮抗性假单胞菌的生物防治活性。
研究人员两株菌株及其相应突变体对致病疫霉不同发育阶段在体外和体内实验中的不同活性表明，生物防治是一个复杂的现象，其中特定分子的作用可能高度依赖于产生菌株、目标病原体以及相互作用的条件（例如在实验室培养基或植物材料上进行）。许多研究确实表明，植物、病原体和周围微生物之间发生了三方相互作用，并且它们的相互作用可能与在二元设置中不同，因为每个相互作用的伙伴都可以释放分子，这些分子可能触发其他伙伴的基因表达变化。此外，重要的是要记住，在叶盘上获得的结果虽然是体内的，但可能不代表在整株植物上或田间条件下会发生的情况。因此，了解吡咯菌素在整个植物和田间试验中的真正作用将是未来研究的重要方向，同时阐明导致缺乏吡咯菌素的菌株生物防治活性增强的机制。尽管如此，研究人员的发现可以帮助改进具体的生物防治策略。了解特定条件下的作用机制和生物防治性状非常重要，可以帮助决定在制剂产品中可能值得增强哪些性状。研究人员的发现表明，在这种特定情况下，吡咯菌素可能不是最佳的候选者。
研究人员创建了不同遗传背景的吡咯菌素突变体，并评估了它们对卵菌多个发育阶段的拮抗作用，以评估吡咯菌素在两株与马铃薯相关的假单胞菌菌株对致病疫霉的拮抗活性中的作用。研究人员发现几乎没有证据表明吡咯菌素直接贡献于拮抗活性。相反，研究人员发现吡咯菌素的贡献强烈依赖于假单胞菌菌株，其缺乏通常导致更高的拮抗活性。考虑到吡咯菌素对铁的高亲和力，以及致病疫霉的生长和发育依赖于铁供应的事实，这一发现是出乎意料的。铁也与寄主植物马铃薯相关，马铃薯在感染时利用铁来防御卵菌。所有这些，以及研究人员的菌株董氏假单胞菌R32额外产生7HT的发现，都显示了铁及其获取对于致病疫霉的毒力
