基于mRNA负载的LNP实现原位CAR-巨噬细胞通过抑制活化HSCs和调节免疫微环境缓解肝纤维化

肝纤维化以细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）异常积累为主要特征，对全球健康构成重大威胁。肌成纤维细胞，主要来源于肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）和门静脉成纤维细胞，是ECM合成的主要驱动者。成纤维细胞激活蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）在活化的HSCs中高表达，是肝纤维化发病机制中的关键因子。阐明HSCs活化的机制并制定遏制其过度活性的策略，对于肝纤维化的管理和预防至关重要。在本研究中，研究人员探索了一种开创性的治疗方法，利用靶向CD163抗体偶联的脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）递送编码FAP特异性嵌合抗原受体巨噬细胞（Chimeric Antigen Receptor Macrophage, CAR-M）的mRNA（αCD163/LNP-FAPCAR）。这些LNPs旨在选择性转导肝脏巨噬细胞，促进体内原位生成FAP特异性CAR修饰巨噬细胞（FAPCAR-M）。研究发现，这些LNPs能够高效转导巨噬细胞，增强其对靶细胞的吞噬能力。这导致了ECM的显著减少，同时促进了肝纤维化的消退。该研究的总体目标是精准靶向并中和过度活化的成纤维细胞，为治疗肝纤维化提供一种有前景的途径。

**论文解读**

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程，其核心特征是肝内细胞外基质（ECM）的过度沉积。活化的肝星状细胞（HSCs）是产生ECM的主要效应细胞，其表面高表达的成纤维细胞激活蛋白（FAP）被视为一个理想的治疗靶点。然而，目前的治疗手段，包括靶向活化成纤维细胞的CAR-T细胞疗法，面临着细胞持久存活带来的安全风险（如干扰正常伤口愈合）以及靶向特异性不足等问题。因此，开发一种能够精准、安全且可逆地清除活化HSCs的新策略至关重要。《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences）发表的本项研究，旨在探索一种基于脂质纳米颗粒（LNP）的巨噬细胞靶向mRNA递送系统，通过在肝脏内原位编程产生CAR-巨噬细胞（CAR-M），以实现特异性识别和清除活化HSCs，并调节肝脏免疫微环境，从而为肝纤维化治疗提供新的范式。

研究人员为开展此研究，主要采用了以下关键技术方法：首先，构建了靶向FAP的CAR结构，其包含CD28共刺激结构域和CD3ζ信号结构域。其次，制备了表面偶联抗CD163抗体的LNP（αCD163/LNP），用于封装FAPCAR的mRNA，实现对肝脏巨噬细胞的靶向递送。最后，通过体外细胞实验（包括巨噬细胞转染、吞噬和杀伤功能验证）以及体内动物模型（包括四氯化碳CCL₄、胆管结扎BDL及蛋氨酸-胆碱缺乏MCD饮食诱导的肝纤维化小鼠模型），系统评估了该系统的靶向递送效率、治疗效果及潜在机制。

**αCD163/LNP-FAPCAR的设计、制造与表征**
研究人员设计并合成了包含密码子优化序列的FAPCAR mRNA，并将其包裹在LNP中形成LNP-FAPCAR。通过透射电子显微镜（TEM）表征，LNP-FAPCAR呈球形，粒径均匀。为进一步提高对巨噬细胞的递送效率，研究人员在LNP表面偶联了靶向CD163的抗体片段，形成αCD163/LNP-FAPCAR。该修饰纳米粒同样具有良好的球形形态和均一的粒径。稳定性测试表明，αCD163/LNP-FAPCAR在不同温度和pH条件下能稳定保存，并在酸性环境中可释放其mRNA载荷。细胞转染实验证实，与未修饰的LNP相比，αCD163/LNP能显著提高骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）对mRNA的摄取效率和目标蛋白（GFP或FAPCAR）的表达水平。

**αCD163/LNP-FAPCAR的体外功能评估**
功能实验显示，αCD163/LNP-FAPCAR处理的巨噬细胞对FAP⁺ JS-1细胞（一种经TGF-β1诱导的FAP表达细胞系）的吞噬能力和细胞毒性均显著增强。机制上，研究人员发现FAPCAR的表达促进了巨噬细胞向促炎的M1表型极化，表现为CD80、IL-1β、IL-6表达升高，同时抑制了M2标志物如CD206、IL-10和TGF-β1的表达。此外，该处理还显著上调了基质金属蛋白酶12（MMP12）的表达。信号通路分析表明，CAR与靶细胞FAP的结合激活了Syk/NF-κB信号轴，驱动巨噬细胞的促炎重编程。在模拟纤维化的体外环境中，αCD163/LNP-FAPCAR仍能维持对靶细胞的杀伤效果，并能重编程残存的肝星状细胞表型及巨噬细胞表型。

**通过靶向途径将αCD163/LNP-FAPCAR递送至纤维化肝脏中的巨噬细胞**
在CCL₄诱导的纤维化小鼠模型中，体内生物发光成像和药代动力学分析显示，αCD163/LNP能实现肝脏的特异性富集，相比未修饰LNP，其在肝脏中的mRNA表达持续时间更长。流式细胞术和免疫荧光共定位实验证实，αCD163/LNP主要将mRNA递送至肝脏巨噬细胞，而非肝细胞或其他非实质细胞。此外，该纳米粒生物安全性良好，对主要器官、体重及血液生化指标无显著影响。

**αCD163/LNP-FAPCAR在小鼠肝纤维化模型中有效减轻肝损伤**
在多种肝纤维化小鼠模型中，接受αCD163/LNP-FAPCAR治疗的小鼠，其肝损伤指标（羟脯氨酸、ALT水平）和纤维化相关基因表达均显著降低。组织学染色（H&E、天狼星红、马松三色）显示，肝纤维化程度明显减轻。同时，促纤维化标志物（如胶原蛋白III、TGF-β1）表达下调，而与组织修复相关的分子（如MMP12、IL-6）表达上调。与αCD163/LNP-Luc（对照组）和未修饰的LNP-FAPCAR组相比，αCD163/LNP-FAPCAR组表现出最显著的纤维化逆转效果，并能特异性清除FAP⁺细胞。

**αCD163/LNP-FAPCAR通过促进肝组织修复和抑制HSC活化来抑制肝纤维化**
通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，研究人员发现αCD163/LNP-FAPCAR治疗降低了肝组织中HSCs的比例。进一步研究发现，该治疗促进了肝细胞（Heps）的增殖（Ki67⁺、PCNA⁺信号增强）并抑制了其凋亡（Caspase3⁺信号减少），机制上可能与抑制p50和Gadd45b信号通路有关。同时，该治疗直接清除了表达FAP和α-SMA的活化HSCs，并抑制了其纤维化相关基因（如Col1a1, Tgfb1）的表达。

**αCD163/LNP-FAPCAR通过重编程巨噬细胞亚群增强MMP12⁺瘢痕清除表型以缓解肝纤维化**
研究观察到αCD163/LNP-FAPCAR治疗导致肝脏巨噬细胞总体比例下降。scRNA-seq和流式细胞术分析表明，该治疗选择性清除了纤维化肝脏中一部分FAP⁺的巨噬细胞亚群，并诱导脾脏产生FAP特异性的T细胞。更重要的是，该治疗重塑了肝脏巨噬细胞亚群的构成：增加了与瘢痕清除相关的巨噬细胞（SAM）亚群，尤其是MMP12⁺/MMP13⁺的修复性SAM亚群，同时减少了促纤维化的CD9⁺巨噬细胞和增殖性MKI67⁺巨噬细胞。功能实验证实，MMP12⁺巨噬细胞的条件培养基能抑制TGF-β1活化HSCs的纤维化表型。此外，研究人员在不同病因的患者肝纤维化组织中也观察到了FAP的高表达，提示该靶点的潜在普适性。

**讨论与结论**
本研究成功开发了一种CD163抗体偶联的LNP系统，用于靶向递送FAPCAR mRNA，在肝脏内原位编程产生具有特异性识别和清除活化HSCs能力的CAR-巨噬细胞。该策略的优势在于：1）能够选择性清除促纤维化的活化HSCs，同时保护健康的肝细胞；2）原位生成CAR-M可能比系统性给药更安全、更有效；3）利用了瞬时表达的mRNA，降低了长期安全性风险。研究深入阐明了其作用机制，包括通过Syk/NF-κB通路驱动巨噬细胞促炎重编程，通过CD28共刺激结构域增强吞噬作用，并通过改变巨噬细胞亚群组成（尤其是扩增MMP12⁺修复性SAM）来调节免疫微环境，共同促进纤维化消退和肝组织修复。尽管该研究为肝纤维化的巨噬细胞靶向免疫治疗提供了极具前景的新策略，但其临床转化仍需系统评估长期疗效机制和潜在安全问题，如免疫原性及脱靶效应。未来的工作将致力于优化给药方案、开发更低免疫原性的新一代载体，并进行全面的临床前安全性评估。