紫外线(UV)照射是皮肤光老化(photoaging)的主要诱因，可诱导氧化应激(oxidative stress)、炎症反应及细胞外基质(ECM)降解。胶原(collagen)是维持真皮完整性的核心成分，但动物源胶原存在免疫原性及病原体污染风险，而目前已报道的重组胶原常缺乏发挥生物活性所需的稳定三螺旋(triple-helical)构象。本研究提出一种三螺旋重组人源化Ⅰ型胶原(triple-helical recombinant humanized type I collagen, THRCI)，其兼具天然样构象、优异的生物安全性及再生功效。研究人员发现THRCI可支持成纤维细胞(fibroblast)黏附、增殖、迁移及胶原合成，同时抑制细胞内活性氧(ROS)及促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines)。在斑马鱼(Danio rerio)模型中，THRCI可降低氧化应激并缓解UV诱导的尾鳍萎缩(caudal fin atrophy)。在急性UV光损伤小鼠模型中，局部应用THRCI可加速表皮恢复，恢复皮肤水合及屏障功能，增加真皮密度并促进胶原纤维重塑，同时下调IL-6、IL-1β、MMP-1及MMP-9的mRNA表达水平。综上，THRCI在本研究建立模型中展现出有效的光损伤修复特性，是一种具有前景的无动物源胶原生物材料，可用于皮肤再生(skin regeneration)。
论文解读：三螺旋重组人源化Ⅰ型胶原(THRCI)通过细胞外基质(ECM)重塑及抗炎机制促进光损伤皮肤修复
研究背景与意义
紫外线(UV)辐射是引起皮肤光老化(photoaging)的重要外在因素，导致红斑、水肿、弹性丧失、皱纹、色素沉着及真皮细胞外基质(ECM)结构改变，其病理机制主要涉及氧化应激、炎症级联反应及胶原(主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原)降解。传统防晒及外用制剂对真皮胶原损伤的修复尚不完全。动物源Ⅰ型胶原(Type I Collagen, Col I)作为皮肤再生的经典生物材料，存在免疫原性(immunogenicity)和病原体(如病毒)传播风险，且提取过程易破坏其三螺旋构象。重组胶原虽规避了上述问题，但既往大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)表达体系制备的重组Ⅰ型胶原往往因缺乏脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxylase, P4H)辅助修饰而导致三螺旋结构不完整、热稳定性差，限制了临床应用。因此，开发具备稳定三螺旋构象、高生物活性且可规模化生产的人源化重组Ⅰ型胶原具有重要科学与转化价值。该论文发表于《Collagen and Leather》。
研究人员以人Ⅰ型胶原α1链为模板，设计保留(Gly-X-Y)n 重复序列及关键细胞结合 motif GFPGER 的重组蛋白，在大肠杆菌BL21(DE3)中采用冷休克启动子(cspA)表达并引入V-foldon三聚化结构域辅助折叠，经Ni-NTA亲和纯化及凝血酶(thrombin)切除V-foldon后获得三螺旋重组人源化Ⅰ型胶原(THRCI)，并与动物源牦牛肌腱提取Col I对照，系统评价其理化表征、体外细胞活性、抗氧化能力、体内(斑马鱼及昆明小鼠)光损伤修复功效及生物安全性。
主要关键技术方法
研究人员将人源化Ⅰ型胶原基因克隆至pCold III载体转化E. coli BL21(DE3)，100 L发酵诱导表达并纯化带有His6 标签及V-foldon的融合蛋白，凝血酶切除V-foldon得THRCI；圆二色光谱(CD)与傅里叶变换红外光谱(FTIR)鉴定三螺旋构象及熔解温度(Tm )；胰蛋白酶敏感性实验评估结构稳定性；CCK-8检测人包皮成纤维细胞(HFF-1)细胞毒性/增殖，细胞黏附形态学观察，划痕实验测迁移，RT-qPCR检测α-SMA、Collagen I、Collagen III mRNA；DCFH-DA探针及SOD/MDA试剂盒检测UVA/UVB辐照后人角质形成细胞(HaCat)与HFF-1内活性氧(ROS)水平及抗氧化指标；硫酸铜(CuSO4 )诱导斑马鱼幼虫氧化应激模型及UVB诱导尾鳍萎缩模型评估体内抗氧化与抗皱效应；昆明小鼠背部急性UV(UVA+UVB)光损伤模型，局部外用THRCI(0.5 mg/mL)连续7天，DermaLab Combo检测表皮形态、高频超声真皮密度、角质层含水量及经表皮水分丢失(TEWL)，H&E及Masson染色组织学分析，RT-qPCR检测皮肤IL-6、IL-1β、Collagen I、Collagen III、MMP-1、MMP-9表达；兔皮肤刺激、溶血及热原试验评价生物安全性。
研究结果
3.1 Characterization of THRCI（THRCI的表征）
紫外浊度显示THRCI在313 nm吸光度恒定，无异常聚集；SDS-PAGE呈单一条带，MALDI-TOF MS测定分子量15104.0 Da与理论值(15099.7 Da)吻合；CD谱在220 nm处呈正峰、198 nm处呈负峰，为特征三螺旋信号，热变性曲线一阶导数求得熔解温度Tm =37 ℃；FTIR在酰胺Ⅰ带(1637、1655、1670 cm-1 )、酰胺Ⅱ(1554 cm-1 )、酰胺Ⅲ(1240 cm-1 )及酰胺A(3322 cm-1 )呈现典型Ⅰ型胶原特征吸收，热变性后特征峰消失；胰蛋白酶消化实验中天然THRCI 24 h后仍保留84.4±7.21%条带强度，热变性THRCI完全降解，证实THRCI具稳定、蛋白酶抗性的三螺旋结构。
3.2 Cytocompatibility and cellular activity of THRCI（THRCI的细胞相容性与细胞活性）
CCK-8显示THRCI在0.001–1.0 mg/mL浓度下HFF-1细胞活力均≥100%，无细胞毒性；与Col I(0.5 mg/mL)相似，THRCI处理1/3/5天呈时间依赖性促增殖(第5天达122.19±1.58%)；包被孔中HFF-1呈纺锤形伸展(BSA组为圆形)，证实含GFPGER基序促细胞黏附；划痕实验24 h迁移率THRCI组51.35±5.50%、Col I组52.39±7.16%，显著高于空白组(19.04±7.58%)；RT-qPCR显示THRCI上调α-SMA(成肌纤维细胞分化标志)、Collagen I及Collagen III mRNA，表明THRCI促ECM合成及成纤维细胞表型转化。
3.3 Antioxidant ability of THRCI in vitro（THRCI体外抗氧化能力）
UVA辐照HFF-1及UVB辐照HaCat后，模型组ROS荧光强度显著升高；THRCI或Col I预处理明显降低荧光强度(与流式细胞术结果一致)；THRCI提升HaCat与HFF-1中超氧化物歧化酶(SOD)活性分别至模型组的2.37倍和1.54倍，并降低丙二醛(MDA)含量，证实THRCI通过增强内源性抗氧化酶、抑制脂质过氧化发挥细胞光保护作用。
3.4 Antioxidant effect in vivo（体内抗氧化效应）
CuSO4 诱导斑马鱼幼虫氧化应激模型中，THRCI处理组相对荧光强度降至33.58±2.18%(阴性对照组归一化为100%)，与阳性对照二钾甘草酸(DPG, 35.17±3.46%)及Col I组(34.20±6.16%)无显著差异，说明THRCI具体内抗氧化活性。
3.5 Anti-wrinkle effect of THRCI in vivo（体内抗皱效应）
UVB致斑马鱼尾鳍萎缩模型中，阴性组相对尾鳍面积降至55.16±6.33%，THRCI组恢复至87.77±5.96%，茶多酚(正对照)组92.76±9.38%，Col I组87.72±6.14%，各组与空白(100%)差异均有统计学意义但THRCI接近正对照，表明THRCI有效拮抗UV诱导的尾部组织萎缩。
3.6 Biological safety of THRCI（THRCI的生物安全性）
新西兰兔皮肤刺激试验中THRCI敷料贴敷区各时点红斑与水肿评分均为0，原发刺激指数(PII)=0；兔红细胞溶血率THRCI为0.98%、Col I为1.04%，低于ISO 10993-4限值(<5%)；兔静脉热原试验累积体温升幅THRCI为0.9 ℃(生理盐水0.1 ℃，Col I 0.8 ℃)，符合《中国药典》非热原要求(≤1.3 ℃)，综合证实THRCI具良好生物相容性。
3.7 DermaLab combo assessment of the ability of THRCI to repair photodamaged skin（DermaLab Combo评估THRCI修复光损伤皮肤能力）
小鼠UV造模后，THRCI与Col I组第5天结痂脱落伴轻度红斑、第7天红斑消退恢复至基线外观，模型组持续红斑；超声示第3/5/7天THRCI组真皮密度(28.32→33.70→47.59→59.72)显著高于模型组且第7天与空白组无差异；THRCI组第7天角质层含水量恢复至空白水平，经表皮水分丢失(TEWL)第7天回至基线，模型组未恢复；表明THRCI加速表皮修复、恢复真皮密度、水合及屏障功能。
3.8 Histological analysis and gene expression in THRCI on photodamaged skin（THRCI对光损伤皮肤的组织学分析及基因表达）
H&E染色：THRCI组第3天见痂皮脱屑伴表皮基底层再生，第7天表皮厚度及真皮-表皮连接与空白组无差异，模型组仍见表皮增生及连接模糊。Masson染色：第7天THRCI组胶原容积分数(45.08±4.89%)与空白组无差异且胶原纤维排列趋正常，模型组仅37.35±6.33%；RT-qPCR示THRCI下调皮肤IL-6(≈0.74倍模型)、IL-1β(≈0.73倍)，上调Collagen I(1.53倍)、Collagen III(1.64倍)，下调MMP-1(≈0.51倍)、MMP-9(≈0.76倍)，与Col I趋势相当。
3.9 Mechanisms of THRCI in promoting repair of photodamaged skin（THRCI促进光损伤皮肤修复的机制）
THRCI通过抑制促炎因子(IL-6、IL-1β)表达减轻过度炎症，抑制基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-9)减少ECM降解，同时上调成纤维细胞Col I及Col III合成并促进其向肌成纤维细胞分化(↑α-SMA)，协同实现ECM重塑与光损伤修复。
讨论与结论总结
在本研究中，研究人员构建了具天然样三螺旋构象(Tm =37 ℃)、蛋白酶抗性且高纯度(≈80%前体，切后单一组分)的三螺旋重组人源化Ⅰ型胶原(THRCI)，其在大肠杆菌系统中实现约2.0 g/L产量。体外实验证实THRCI支持人皮肤成纤维细胞黏附、增殖、迁移及ECM合成基因上调，并降低UV诱导的细胞内ROS、提升SOD活性及降低MDA。斑马鱼模型显示THRCI具体内抗氧化及缓解UV致尾鳍萎缩作用。小鼠急性UV光损伤模型中，局部应用THRCI加速表皮再生、恢复皮肤水合与屏障(TEWL及超声真皮密度改善)、促进胶原纤维网络重构(Masson染色胶原含量恢复)，并下调炎症因子(IL-6、IL-1β)及基质降解酶(MMP-1、MMP-9)mRNA、上调胶原合成基因。皮肤刺激、溶血及热原试验证实良好生物安全性。结论为：THRCI凭借稳定的三螺旋结构与生物活性，通过ECM重塑及抗炎/抗氧化双重机制有效促进光损伤皮肤修复，是一种具临床转化潜力的无动物源胶原生物材料，适用于皮肤再生与抗光老化领域。
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