祖先蛋白重建揭示一种热耐受性Rieske氧化酶，其对3-O-甲基没食子酸的O-去甲基化活性增强

木质素的生物高值化利用为获得高附加值化学品提供了一条可再生路径，但其工业实施受到O-去甲基化酶固有不稳定性和低效率的限制。在本研究中，研究人员采用祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction，ASR）复活了VanA型Rieske非血红素铁氧化酶（Rieske nonheme iron oxygenases）的高稳定性和高效率变体；这类酶以往因工程改造困难而著称。所获得的先导祖先变体AncVanA3表现出前所未有的约30 °C熔解温度提升（67 °C），且其可溶性产量较现生XacVanA提高7倍。关键的是，AncVanA3对难降解木质素单体3-O-甲基没食子酸（3OMG）的催化转化能力更优，在丁香酸到没食子酸的漏斗化通路中实现了92%的转化率。分子动力学模拟表明，这种活性增强源于涉及V300门控残基的门控机制被破坏，从而形成持续开放且扩大的底物结合口袋。最重要的是，经由质量光度法（mass photometry）进行的生物物理表征显示，这些酶在溶液中主要以单体形式存在。这一发现挑战了当前关于Rieske氧化酶会自组装为内在稳定的同源三聚体、以促进亚基间电子转移的主流观点。综上，这些结果不仅为木质素升级利用提供了稳健的技术平台，也为生物无机催化中的电子转移研究提出了新的机制框架。

该论文发表于《ACS Synthetic Biology》，聚焦木质素来源芳香化合物生物转化过程中的关键瓶颈——O-去甲基化步骤。木质素是地球上最丰富的可再生芳香碳源之一，具有转化为化学品、燃料和材料的重要潜力。然而，木质素本身结构复杂、异质性强且难以降解，导致其工业化高值利用长期受限。当前，利用微生物代谢漏斗将多种木质素衍生芳香化合物汇聚为单一高附加值产物，被认为是推动生物炼制体系落地的有效策略。在这一过程中，O-去甲基化是决定代谢通量和转化效率的核心反应之一，尤其在Pseudomonas putida KT2440等宿主中，该步骤往往效率不足，成为实际应用中的明显限制因素。

现有细菌O-去甲基化酶主要包括细胞色素P450单加氧酶、四氢叶酸（tetrahydrofolate，THF）依赖型酶以及Rieske非血红素铁氧化酶三大类。其中，VanAB型Rieske O-去甲基化系统不仅能够作用于香草酸，还可识别丁香酸、3-O-甲基没食子酸（3OMG）等多种甲氧基化酚酸，因此在木质素芳香单体的漏斗化利用中具有重要价值。但这类酶普遍存在单核铁位点不稳定、辅因子装载不完全、异源表达易错误折叠、纯化后不稳定以及O₂偶联效率不足等问题，使其结构解析与理性改造都十分困难。尤其是VanA系统缺乏实验解析结构，严重制约了定向工程设计。因此，开发兼具高稳定性与高催化效率的新型VanA氧化酶，具有明确的科学意义与工程价值。

为应对上述问题，研究人员引入祖先序列重建（ASR）策略，从超过1000条XacVanA同源序列构建系统发育框架，选择4个关键祖先节点并复活得到AncVanA1、AncVanA2、AncVanA3和AncVanA4四种祖先酶。研究目标是通过进化信息挖掘获得比现生XacVanA更稳定、更易表达且催化性能更优的祖先变体，并进一步解析其结构基础与作用机制。研究结果表明，4种祖先酶均保留了与现生还原酶XacVanB形成功能复合物的能力，说明VanAB亚基间相互作用界面具有较高保守性。其中，AncVanA2在香草酸O-去甲基化中表现最佳，而AncVanA3在3OMG去甲基化以及丁香酸至没食子酸两步转化中表现最突出。尤其AncVanA3不仅熔解温度显著升高，且纯化可溶产率大幅提升，对3OMG表现出最优转化能力，成为本研究最具应用前景的先导分子。

研究人员用于开展该研究的主要技术方法可概括如下：首先，基于UniParc数据库序列检索、HMM构建、多序列比对、系统发育分析与GRASP软件实施祖先序列重建（ASR）；其次，在Escherichia coli中进行异源共表达，并结合全细胞生物催化与高效液相色谱（HPLC）评估底物转化性能；再次，采用差示扫描荧光法（DSF）测定热稳定性，利用质量光度法（mass photometry）及SEC-MALS分析寡聚状态；最后，结合AlphaFold预测、PDBePISA界面分析以及分子动力学（MD）模拟，解析底物结合口袋动态与结构机制。宿主验证实验采用P. putida KT2440工程菌株。

Results Ancestral Rieske O-Demethylases Exhibit Enhanced Solubility
研究人员首先通过系统发育分析，将大量XacVanA同源蛋白划分为不同分类群分支，并从关键分化节点复活4种祖先氧化酶。异源表达与纯化结果显示，所有祖先酶的可溶性均优于现生XacVanA。XacVanA纯化后可溶产量仅为5 mg/L培养液，而AncVanA1、AncVanA2、AncVanA3和AncVanA4分别达到11、20、34和27 mg/L。CamSol预测结果与实验测得的可溶产量高度一致，说明ASR可有效改善Rieske O-去甲基化酶的可溶性，这是后续性能优化的重要基础。

Resurrected Ancestral Enzymes Retain the O-Demethylase Function of XacVanA but Exhibit Variable Performance Profiles
由于难以获得稳健的体外稳态动力学参数，研究人员采用E. coli全细胞催化体系评估功能。结果表明，所有祖先酶都必须与XacVanB共表达才显示活性，说明其均保留了与现生还原酶配对的功能。以丁香酸为底物时，不同祖先酶表现出显著底物依赖性差异。AncVanA4转化最慢，并明显积累中间体3OMG；AncVanA1活性也相对较低。AncVanA3虽然在第一步去甲基化中初速不及XacVanA，但在第二步3OMG向没食子酸转化中更高效，使整体丁香酸至没食子酸转化率达到92%，高于XacVanA的76%。以3OMG为直接底物时，AncVanA3同样表现最优，24 h内可实现84%转化，高于XacVanA的75%。在不同初始细胞浓度条件下，AncVanA3的优势具有良好重现性，最多可产生比XacVanA高5倍的没食子酸。以香草酸为底物时，AncVanA2表现最佳，显示其对不同底物具有不同最优变体。该部分结果说明，ASR不仅保留了酶功能，还重塑了底物偏好与催化谱。

Ancestral Rieske O-Demethylases Exhibit Enhanced Thermal Stability with Variant-Specific Oligomeric Behavior
针对表现较优的AncVanA2和AncVanA3，研究人员进一步检测热稳定性和组装状态。DSF结果显示，两者的平均熔解温度均比XacVanA高近28 °C，显示出显著热耐受性增强。质量光度法进一步揭示，XacVanA和AncVanA2在近生理条件下均以单体为主，分别占检测群体的76%和73%，仅有少量三聚体。AncVanA3虽然仍以单体为主，但三聚体比例增至26%。AlphaFold3结构预测结合PDBePISA分析提示，AncVanA3可能具有更大的埋藏界面面积与更有利的溶剂化自由能收益，从而解释其更强的三聚化倾向。值得注意的是，AncVanA3在缓冲液置换、浓缩和储存过程中明显更稳定，不易沉淀，并可通过SEC和SEC-MALS重复分析。该部分结果表明，ASR不仅提高热稳定性，也可重塑Rieske O-去甲基化酶的寡聚平衡与整体结构稳定性。

XacVanA and Ancestral Enzymes Conserve Canonical Rieske Motifs while Exhibiting a Noncanonical Substitution in a Substrate-Coordinating Residue
通过序列与结构比较，研究人员发现XacVanA及其祖先变体严格保留了Rieske簇所需的2Cys–2His基序，以及单核铁结合所需的2His–1Asp配位模式，说明其催化核心高度保守。此前推测参与香草酸氢键结合的3个残基中，有2个在XacVanA及祖先酶中保留，而另一位点Q291则被Val替代，形成非经典Q291V替换。这一特征也见于部分Corynebacteriales来源VanA序列。进一步通过与dicamba O-去甲基化酶（DMO）结构对照进行手工对接，研究人员发现XacVanA与AncVanA3的预测底物结合位点在氨基酸组成和侧链构象上几乎相同，且均可容纳香草酸、丁香酸和3OMG。因此，活性差异不太可能来源于经典底物识别残基本身，更可能与活性位点周边或远端区域的动态特征有关。

研究人员随后利用分子动力学（MD）模拟检验这一假设。结果显示，XacVanA底物结合区存在明显的开闭转换，而AncVanA3在模拟过程中始终保持开放构象。XacVanA中V300残基靠近底物口袋，其构象翻转与口袋关闭相关；同时，远端R212–D286盐桥的破坏也与底物口袋体积缩小相关。当盐桥保持稳定时，口袋体积维持在200–300 ų；一旦破坏，则伴随局部螺旋移动和口袋遮蔽。相比之下，AncVanA3具有更大的底物结合口袋，V311与V271之间持续保持较远距离，未观察到类似V300翻转事件，说明其缺乏相应门控机制。此外，AncVanA3中的R294–D222残基对在轨迹中保持稳定接触，且承载门控残基的长螺旋在N端局部无序、长度较短，这些因素共同削弱了口袋关闭能力。由此可见，AncVanA3对3OMG的高效催化，主要与远离活性中心的序列变化导致底物口袋持续开放和可达性增加有关。

Ancestral and Extant VanA Variants Exhibit Divergent Behavior in P. putida KT2440
为评价应用潜力，研究人员将AncVanA3与XacVanB共表达于P. putida KT2440中，并与XacVanAB及P. putida自身VanAB系统比较。结果显示，出乎意料的是，AncVanA3在该宿主中几乎不能有效去甲基化丁香酸或3OMG，其表现与阴性对照接近；相反，XacVanAB和PpVanAB均可在24 h内耗尽芳香底物。干细胞重分析进一步表明，表达AncVanA3的菌株在丁香酸或3OMG条件下均表现出生物量下降，提示该祖先酶在KT2440中可能引发细胞负担或毒性，进而造成质粒不稳定或功能丧失。这一结果强调，酶在E. coli中的优越性能并不能直接外推至其他工业底盘，宿主兼容性仍是工程化应用中的关键约束。

讨论部分指出，本研究通过ASR从超过1200条VanA样序列中有效筛选并复活了4种祖先酶，证明基于进化信息的序列空间压缩是发掘高性能酶的重要策略。所有祖先酶均可与XacVanB形成活性复合物，而与旁系还原酶仅显示残余活性，支持VanAB界面受协同进化约束的观点。更重要的是，研究人员通过生物物理测量发现，现生XacVanA及主要祖先变体在体外条件下都以单体为主，这对传统Rieske氧化酶需要稳定三聚体以进行亚基间电子转移的范式提出挑战。尽管作者并未否认体内高阶组装的可能性，但该结果为VanAB系统电子转移路径提供了新的概念框架。另一方面，MD模拟进一步表明，AncVanA3的优势并非简单来源于活性位点保守残基变化，而是源于远端结构元件改变了口袋门控行为，使酶处于持续开放状态，促进底物进入和产物释放。这一认识拓展了对Rieske氧化酶催化调控机制的理解。

研究结论可译为：本研究成功复活了具有增强热耐受性并重塑催化谱的祖先VanA变体，获得了一个对木质素高值化利用中3OMG瓶颈步骤具有更优活性的先导酶。通过证明这些酶在溶液中主要以单体形式存在，研究人员为理解Rieske O-去甲基化酶的电子转移与组装方式提供了新的概念框架。尽管宿主约束仍是实际应用障碍，但将祖先序列重建（ASR）与机制解析相结合，为推动VanAB系统在可持续化学品生产和木质素生物转化中的工程改造提供了一种稳健策略。